通过挥发组学、感官组学和非靶向代谢组学分析揭示酸奶发酵过程中香气活性化合物的代谢机制

《Journal of Dairy Science》：Unveiling metabolic mechanism of aroma-active compounds during yogurt fermentation through volatilomics, sensomics, and untargeted metabolomics analysis

　　

酸奶的风味主要由其香气活性化合物决定。本研究旨在追踪酸奶发酵过程中（0、60、120、180和240分钟）的理化、微生物学、风味变化及代谢组学特征。当pH降至4.54且酸度升至72.8 °T时，终止发酵。挥发组学鉴定出13种可区分不同发酵阶段的挥发性化合物。同时，感官组学分析检测到13种香气活性化合物。整合这两组数据，得到7种高度变化的香气活性化合物（OAV >1且VIP >1）。此外，非靶向代谢组学结合多变量统计分析，在发酵过程中鉴定出81种极显著差异代谢物。对这些代谢物进行的KEGG富集分析揭示了10条途径（p < 0.05）。相关性分析表明，包括乙酸、己酸和2,3-戊二酮在内的香气活性化合物的积累受hub代谢途径调控，如乙醛酸和二羧酸代谢、柠檬酸（TCA）循环，以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸及丙酮酸代谢。在该网络中，关键的节点代谢物，即丙酮酸、二氢尿嘧啶、柠檬酸、尿嘧啶、乳清酸、苹果酸和异柠檬酸，被确定为可能参与挥发性风味形成的hub代谢物。这项工作描绘了发酵风味的代谢网络基础，为理性设计酸奶香气提供了明确的工程目标。

论文解读

研究背景与意义

酸奶作为一种由嗜热链球菌（Streptococcus salivarius ssp. thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus）共同发酵的乳制品，其独特的香气源于发酵过程中产生的复杂挥发性代谢物网络。尽管既往研究广泛分析了成品酸奶的挥发性成分，或通过添加外源物质（如多糖、石斛）来修饰风味，但关于发酵过程中代谢途径随时间动态演变的时间分辨代谢谱仍属空白。这种认知的缺失阻碍了对风味形成起源的系统理解。鉴于此，研究人员以最基础的发酵型酸奶为模型，旨在通过整合多组学技术，在代谢层面揭示风味化合物形成的动态机制，为后续的风味理性设计和精准调控提供科学基础。该论文发表在《Journal of Dairy Science》。

主要关键技术方法

研究人员采用实验室标准流程制备酸奶，以复原乳为底物，接种商业化直投式菌种，分别在发酵的0、60、120、180和240分钟进行取样。核心技术体系包括：利用顶空固相微萃取箭头结合气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-Arrow-GC-MS）对挥发性风味化合物进行定性与半定量分析；结合气相色谱-嗅闻技术（GC-O）鉴定香气活性化合物并计算气味活度值（OAV）；应用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF MS）进行非靶向代谢组学分析以捕捉非挥发性代谢物的动态变化；最后，通过多元统计分析（PLS-DA、PCA）及KEGG通路富集分析，解析差异代谢物与关键香气物质之间的相关性。

研究结果

理化分析与活菌计数

随着发酵进行，酸奶pH从6.53显著下降至4.54，滴定酸度从14.98 °T上升至72.8 °T，粘度在120分钟后显著增加。细菌生长曲线显示，前期（0-60分钟）为适应期，生长缓慢；中期（120分钟左右）进入指数增长期，活菌数达到约2.7 × 10⁸cfu mL^?1，伴随着乳糖快速代谢为有机酸；后期（180-240分钟）由于营养耗尽和酸性抑制，生长趋于平稳，最终活菌数在3.7 × 10⁸至6.2 × 10⁸cfu mL^?1之间，此时酪蛋白达到等电点形成凝胶网络。

挥发性风味动力学

在发酵过程中共鉴定出73种挥发性化合物。主成分分析（PCA）将发酵过程明确划分为三个阶段：初期（0-60分钟）、中期（120分钟）和后期（180-240分钟）。利用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）筛选出13种高变异挥发性代谢物（VIP >1），主要包括酸类、醛类和酮类。GC-O分析进一步识别出18种香气活性物质，其中13种的浓度高于其气味阈值。通过整合OAV >1和VIP >1的双重标准，研究人员锁定了7种高度变化的香气活性化合物，分别为2,3-戊二酮、乙酸、丁酸、己酸、二甲基砜、庚酸和辛酸，这些短链和中链脂肪酸是驱动发酵不同阶段风味转变的核心。

非挥发性代谢物分析

非靶向代谢组学共注释到1155种非挥发性代谢物，其中脂质和类脂分子占比最高（28.83%）。PCA和PLS-DA模型均能有效区分不同发酵时间点的代谢谱。通过设定严格的统计学阈值（VIP >1, p < 0.01, |log₂FC| > 1），筛选出81种高度差异的非挥发性代谢物。其中，有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子、碳水化合物及其结合物表现出显著的动态变化。例如，作为风味前体物质的氨基酸在发酵初期丰富，随后被消耗；而丙酮酸、乳酸等关键中心代谢物则在发酵后期显著积累。

关键代谢途径解析

KEGG富集分析显示，这81种差异代谢物主要映射到10条显著相关的代谢途径（p < 0.05），包括乙醛酸和二羧酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）、丙酮酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等。这些途径构成了一个动态互联的网络，通过协调能量供应和前体可用性，直接影响挥发性风味化合物的形成。

相关性分析

通过构建关键香气化合物与非挥发性代谢物的关联网络，研究发现丙酮酸和二氢尿嘧啶与所有7种关键香气活性化合物呈强正相关。丙酮酸作为核心节点，不仅是脂肪酸生物合成的前体，也是2,3-戊二酮的直接前体。相反，柠檬酸、苹果酸、异柠檬酸（TCA循环中间体）以及尿嘧啶、乳清酸（嘧啶代谢前体）则与香气活性化合物呈强负相关，这表明随着发酵进行，碳流从TCA循环被重新定向至脂肪酸的合成路径中。

讨论与结论总结

讨论部分指出，虽然乙醛和双乙酰常被视为酸奶标志性香气成分，但在本研究的动态视角下，中短链脂肪酸由于其在240分钟内持续积累的动力学特征，更能反映发酵过程中的代谢活性，从而成为区分发酵阶段更好的动态标记物。研究证实，风味形成并非单一途径作用，而是由丙酮酸代谢、TCA循环等多条途径交叉调控的结果。

结论部分明确，本研究以关键香气活性化合物为核心，将其与非挥发性代谢物相关联，成功将酸奶发酵过程中的动态风味表型与底层的关键代谢途径相耦合。研究确定了以中短链脂肪酸为主的7种标志性香气化合物，揭示了包含81种差异代谢物的10条核心代谢途径。丙酮酸被确立为连接多种香气化合物的中枢节点。这些发现为发酵乳制品的风味调控提供了重要的相关性框架，未来通过靶向代谢组学和酶学验证将进一步确立其因果关系。