AI设计的环肽实现CD28免疫检查点(immune checkpoint)的可控调节

《Advanced Science》：AI-Designed Cyclic Peptides Enable Controllable Modulation of the CD28 Immune Checkpoint

　　

免疫检查点(immune checkpoint)疗法已变革免疫治疗，但仍以生物制剂(biologic agents)为主，其具有受体占据时间长、药理可控性有限等局限。尽管存在多种免疫调节剂，能直接靶向胞外免疫检查点蛋白-蛋白相互作用(protein–protein interaction, PPI)界面并实现可控免疫调节的合成模态(modality)仍较少被探索。本研究报道一种AI引导的策略，用于发现共刺激受体CD28的环肽拮抗剂(antagonist)。先导肽CIP-3以纳摩尔(nanomolar)级亲和力结合CD28胞外域(extracellular domain, ECD)，破坏CD28-配体(ligand)相互作用。在原代人类免疫系统中，CIP-3抑制CD28依赖性T细胞活化且无内在激动(intrinsic agonist)活性，并表现出快速的药理可逆性(reversibility)，可实现暴露依赖性的免疫信号调控。在慢性结肠炎(colitis)T细胞过继转移(transfer)模型中，CIP-3呈剂量依赖性治疗效果并降低系统性炎性细胞因子(cytokines)。CIP-3在独立健康供体和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)患者来源的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中均可抑制细胞因子产生，疗效与基准抗CD28生物制剂相当。综上，结果表明AI设计环肽作为可控合成模态用于免疫检查点调节的潜力。

《Advanced Science》刊发研究解读：AI设计环肽对CD28免疫检查点的可控调节

研究背景与立题依据

免疫检查点(immune checkpoint)通路调控适应性免疫反应的强度与持续时间，是肿瘤、自身免疫病及移植医学的重要治疗靶点。以PD-1、CTLA-4为代表的抑制性检查点阻断(blockade)疗法已成功应用于临床。共刺激受体CD28通过与抗原提呈细胞上的CD80/CD86结合放大T细胞受体(TCR)信号，促进细胞因子产生、增殖及存活，其信号异常参与类风湿关节炎和炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)等自身免疫病的发生。目前免疫检查点调节主要依赖单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)或受体融合蛋白如abatacept，存在受体占据时间长、药理可控性差、潜在免疫原性及生产工艺复杂等局限；且CD28胞外域为浅而溶剂暴露的蛋白-蛋白相互作用(PPI)界面，缺乏小分子药物可利用的深疏水口袋，传统小分子难以有效靶向，介于小分子与抗体之间的治疗模态(modality)存在明显空白。环肽(cyclic peptide)凭借构象约束(conformational constraint)、合成可及性及可调控的药代动力学性质，有望填补这一空白，但缺乏系统的免疫检查点环肽发现策略。本研究旨在利用AI引导设计策略发现靶向CD28胞外域的二硫键约束环肽拮抗剂，验证其结合能力、功能拮抗活性、药理可逆性及体内外疗效，证明合成环肽作为可控免疫检查点调节模态的可行性。

主要关键技术方法

研究人员采用Highplay平台集成蒙特卡洛树搜索(Monte Carlo Tree Search, MCTS)强化学习策略与HighFold结构预测模型，以人CD28氨基酸序列为指导，针对CD28胞外域溶剂暴露平坦区域从头设计Cys-X?-X_n-1-Cys二硫键约束环肽，经多标准过滤(i_pLDDT > 0.85、氢键潜力等)筛选候选序列合成并实验验证。通过微量热泳动(microscale thermophoresis, MST)和等温滴定量热(isothermal titration calorimetry, ITC)测定环肽与人CD28胞外域结合亲和力(K_d)及热力学参数。采用CD28-CD80配体结合抑制ELISA评估功能阻断活性(IC₅₀)。利用Jurkat T细胞与抗原提呈细胞共培养NFAT(nuclear factor of activated T-cells)荧光素酶(luciferase)报告系统检测CD28共刺激信号抑制。以健康供体(n=10)及溃疡性结肠炎(UC)患者(n=5)原代外周血单核细胞(PBMCs)抗CD3/CD28刺激模型评估细胞因子(IL-2、IFN-γ)分泌抑制及有无内在激动活性；设洗脱(washout)实验比较环肽与抗CD28抗体(FR104)抑制的可逆性。动物实验采用C.B-17 scid小鼠CD4⁺CD45RB^highT细胞过继转移慢性结肠炎模型，评估CIP-3剂量依赖性疗效、体重、结肠长度、血清炎性因子及急性耐受性。

研究结果

2.1 AI-Guided Discovery Identifies Cyclic Peptide Ligands Targeting the CD28 Extracellular Interface（AI引导发现靶向CD28胞外界面的环肽配体）

研究人员以CD28胞外域浅平配体结合区为靶面，通过Highplay-HighFold平台进行序列生成与结构评估，经消融实验确定pLDDT为最优强化学习奖励信号。从设计库中选取三个二硫键约束环肽（CIP-1、CIP-2、CIP-3，即cyclic immune peptides, CIPs）进行实验验证。结构建模显示三者均占据CD28配体结合界面邻近区域，提示可通过空间位阻干扰CD80/CD86结合。

2.2 Cyclic Peptide CIP-3 Binds CD28 With Nanomolar Affinity（环肽CIP-3以纳摩尔亲和力结合CD28）

MST结果显示CIP-1无 detectable 结合，CIP-2表观K_d≈47.16 μM，CIP-3 K_d≈108 nM（95% CI: 77–144 nM）；ITC测得CIP-3与CD28 ECD的K_d≈80 nM，结合计量比n=1，为负焓负熵驱动特异性结合。CIP-3形成稳定α-螺旋构象并具高形状互补性(shape complementarity, S_c=0.77)，其Trp-5吲哚环深入CD28疏水口袋优化相互作用，而CIP-1(S_c=0.63)因界面空隙大、去溶剂化不完全导致无有效结合。

2.3 CIP-3 Disrupts CD28-Ligand Interactions（CIP-3破坏CD28-配体相互作用）

CD28-CD80结合抑制实验中，CIP-2 IC₅₀=59.3 μM，CIP-3 IC₅₀=609 nM，约65倍活性提升，表明CIP-3通过结合CD28配体结合界面邻近区域竞争性阻断天然共刺激配体结合。

2.4 Cyclic Peptide Antagonists Suppress CD28-Dependent Signaling in Cellular Systems（环肽拮抗剂抑制细胞中CD28依赖性信号）

Jurkat T细胞/抗原提呈细胞共培养NFAT报告实验显示CIP-2 IC₅₀=10.1 μM，CIP-3 IC₅₀=443 nM，细胞水平抑制效价与生化结合及竞争抑制趋势一致，证实环肽可在细胞环境中功能性拮抗CD28共刺激信号。

2.5 CIP-3 Reproduces Biologic-Like Immune Modulation in Primary Human Systems（CIP-3在原代人免疫细胞系统中再现类生物制剂免疫调节效果）

健康供体PBMCs抗CD3/CD28刺激下，CIP-3浓度依赖性抑制IL-2及IFN-γ分泌，在10名独立供体中重现，高浓度下抑制幅度与基准抗CD28阻断抗体FR104相当，具亚微摩尔功能效价。

2.6 CIP-3 Exhibits no Intrinsic Agonist Activity and Mediates Reversible Checkpoint Modulation（CIP-3无内在激动活性且介导可逆的检查点调节）

单独给予CIP-3(0.01–10 μM)不引起PBMCs细胞因子升高，排除内在激动风险。洗脱实验中，CIP-3预处理后移除未结合肽，T细胞信号恢复至约85%刺激对照组水平，而FR104处理组仅恢复约30%，表明CIP-3通过非共价短暂结合实现快速药理可逆性，区别于抗体的长时受体占据。

2.7 CIP-3 Suppresses CD28-Mediated Cytokine Production in T Cells Derived From Patients With Ulcerative Colitis（CIP-3抑制UC患者来源T细胞的CD28介导细胞因子产生）

UC患者PBMCs中CIP-3剂量依赖性抑制IL-2与IFN-γ，1 μM时稳定抑制且个体间差异小；与配对样本中FR104(10 μg/mL)相比抑制率无显著差异(p>0.05)。线性CIP-3对照无抑制活性，证实二硫键环化及构象预组织(preorganization)为功能必需。

2.8 CIP-3 Demonstrates Favorable Acute In Vivo Tolerability Without Detectable Systemic Cytokine Release（CIP-3体内急性耐受良好且无可检测系统性细胞因子释放）

健康小鼠皮下给予CIP-3(5或10 mg/kg)未见行为异常或体重下降，血清IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-2与溶媒对照组无差异，血常规及肝肾功能指标无显著改变，无急性全身毒性或细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome, CRS)迹象。

2.9 CIP-3 Demonstrates Dose-Dependent Therapeutic Efficacy in a T-Cell Transfer Model of Colitis（CIP-3在T细胞转移结肠炎模型中具剂量依赖性治疗效果）

在CD4⁺CD45RB^highT细胞过继转移慢性结肠炎模型中，CIP-3皮下给药减轻体重丢失、改善腹泻评分、减少结肠缩短及降低血清炎性细胞因子，呈剂量依赖性保护效应，证实其在体靶向鼠CD28并缓解炎症表型。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，传统免疫检查点调节剂特别是针对共刺激受体的生物制剂存在受体长效占据致调控僵化及潜在安全性隐患，而CD28胞外浅界面长期被视为"难成药"(undruggable)。本研究通过整合强化学习与高精度结构预测的AI设计框架，高效筛选出可结合CD28并阻断CD80/CD86相互作用的二硫键约束环肽，其中CIP-3达纳摩尔亲和力、有效抑制原代T细胞活化、无激动活性且具快速可逆性——后者允许依暴露量精细调谐免疫抑制强度，为自身免疫病等需灵活停药或剂量调整的场景提供优势。CIP-3在健康人及UC患者PBMCs中疗效媲美抗CD28单抗，并在结肠炎动物模型中验证在体疗效与耐受性。研究表明AI设计环肽可弥合小分子与生物制剂间的模态鸿沟，为免疫检查点——尤其是具安全风险的共刺激受体——提供了可药理化、可控的新型合成治疗模态，并为其他难成药蛋白-蛋白界面的配体设计建立了范式。

结论（翻译）

综上，研究人员建立了以环肽作为可控合成模态靶向免疫检查点受体CD28的策略。通过AI引导发现流程获得靶向CD28胞外域的环肽拮抗剂，AI设计环肽以纳摩尔亲和力结合CD28，破坏受体-配体相互作用，并在多种原代人免疫系统模型中抑制CD28依赖性T细胞活化。重要的是，肽介导的拮抗具可逆药理特征且无内在激动活性，区别于基于抗体的方法。CIP-3在慢性结肠炎T细胞转移模型中呈剂量依赖性治疗效果，并抑制来自健康供体及溃疡性结肠炎患者的PBMCs细胞因子产生，疗效与基准抗CD28生物制剂相当。这些结果确立了环肽作为可实现可控免疫检查点调节的合成模态，并为靶向共刺激受体的下一代免疫疗法提供了框架。