GPX3通过维持肝细胞线粒体质量控制以增强肝脏再生中的巨噬细胞促再生表型

《Clinical and Translational Medicine》：Glutathione peroxidase 3 preserves hepatocyte mitochondrial quality control to enhance macrophage pro-regenerative phenotype during liver regeneration

　　

背景：肝脏功能的精确调控对于肝脏再生至关重要。然而，其潜在的调控机制仍不清楚。本研究旨在探讨肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶3（GPX3）在肝脏再生中的作用。
方法：在70%部分肝切除术（partial hepatectomy, PH）小鼠模型中，免疫染色和单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示PH术后线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）通路显著富集但表达下调，同时肝细胞中缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1a, HIF-1a）和GPX3表达上调。单细胞分析证实GPX3在肝细胞中的表达在PH术后第2天达到峰值。肝细胞特异性GPX3敲除（hepatocyte-specific GPX3 knockout, HKO）损害线粒体功能并延迟肝脏再生。
结果：在机制上，免疫沉淀-质谱（immunoprecipitation-mass spectrometry, IP/MS）和MitoCarta3.0分析确定电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1, VDAC1）是GPX3的直接结合伙伴。GPX3通过其A2结构域（残基75–150）与VDAC1相互作用，抑制VDAC1寡聚化，从而恢复线粒体Ca2+稳态并维持线粒体质量控制（mitochondrial quality control, MQC）。值得注意的是，GPX3缺乏促进线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）释放，激活巨噬细胞中的环状GMP-AMP合酶（cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）-干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）通路。持续的STING过度活化增加了干扰素（interferon, IFN）的产生，同时抑制了肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）的释放，进一步抑制了再生。关键的是，在PH和肝脏缺血-再灌注损伤模型中，GPX3过表达均增强了肝脏再生，突显了其在不同再生应激中的核心作用。
结论：总之，GPX3通过抑制VDAC1寡聚化来稳定线粒体Ca2+动态和MQC，同时防止mtDNA介导的巨噬细胞功能和表型改变，从而促进肝脏再生，这使其成为肝脏再生治疗的一个潜在靶点。

肝脏在部分肝切除术（partial hepatectomy, PH）、活体肝移植或急慢性肝损伤后具有独特的再生能力，这对于肝功能恢复至关重要。肝脏再生受损可导致肝功能障碍甚至肝衰竭。然而，肝脏再生的精确调控机制仍不明确，且有效的促再生策略仍缺乏，这提示鉴定关键分子和细胞参与者的重要性。肝细胞再生是肝脏再生的标志性特征之一。当肝脏损伤或组织丢失时，静止的肝细胞重新进入细胞周期快速增殖，以使肝脏恢复到损伤前的大小和重量。多种细胞外和细胞内信号通路在调控肝细胞再生中发挥重要作用。线粒体作为细胞能量工厂，对于肝脏再生不可或缺。肝切除术后，线粒体通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP以满足肝细胞增殖的生物能量需求。有趣的是，有报道称OXPHOS在肝脏再生早期受到抑制，期间可能存在特定的调控机制，以确保线粒体为再生过程提供足够能量。线粒体质量控制（mitochondrial quality control, MQC）涵盖了线粒体生物发生、线粒体动力学和线粒体自噬等关键过程，对于稳定线粒体功能至关重要。然而，MQC在肝脏再生过程中是否以及如何被调控仍知之甚少。巨噬细胞是肝脏中最丰富的非实质细胞之一，在肝脏损伤和再生中扮演重要角色。环状GMP-AMP合酶（cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）-干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）通路是细胞质DNA激活的关键天然免疫信号级联反应。前期研究表明，巨噬细胞中异常的STING活化显著损害肝脏再生。众所周知，cGAS-STING通路可被线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）激活，本研究发现GPX3缺乏导致mtDNA释放。然而，肝细胞GPX3是否在肝脏再生期间调控这些过程仍不清楚。谷胱甘肽过氧化物酶3（GPX3）是一种内源性抗氧化酶，已被认为与线粒体功能有关。GPX3通过与Mia40相互作用，在调控线粒体氧化还原和蛋白质稳态中发挥功能。GPX3还通过维持线粒体稳态来对抗脂肪重塑中的衰老。外源性GPX3递送已被发现可以减轻肝细胞凋亡和肝损伤。有趣的是，PH会导致肝组织缺氧，伴随缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1a, HIF-1a）表达升高。此外，缺氧已被证明可通过其与HIF-1的特异性结合位点促进GPX3基因诱导。然而，GPX3在调控肝脏再生期间MQC的精确作用和机制仍不清楚。

研究人员开展了以下研究：利用公共单细胞RNA测序数据和70%PH小鼠模型，分析肝脏再生过程中的细胞和分子变化。构建并使用肝细胞特异性GPX3敲除（GPX3^fl/flAlb^Cre）和过表达（AAV8-TBG-GPX3）小鼠模型，在PH和肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia–reperfusion injury, HIRI）模型中评估GPX3的功能。通过免疫共沉淀（Co-IP）、质谱分析、免疫荧光共定位、结构域截短和突变实验鉴定GPX3的下游相互作用蛋白及其结合位点。采用线粒体功能检测试剂盒、Western blot、免疫组织化学、流式细胞术、qPCR、ELISA以及VDAC1寡聚化抑制剂（VBIT-4， VBIT-12）和ROS清除剂（NAC）等进行机制验证。

研究结论表明：肝细胞GPX3在肝脏再生中通过直接结合VDAC1抑制其寡聚化，从而稳定线粒体Ca2+动态和MQC；GPX3缺乏导致VDAC1过度寡聚化，破坏线粒体Ca2+稳态，引发mtDNA泄漏，进而激活巨噬细胞cGAS-STING通路，改变巨噬细胞表型（抑制HGF释放，促进炎症因子和IFN产生），最终抑制肝脏再生。GPX3过表达则能改善线粒体功能并促进再生，在PH和HIRI模型中均显示出保护作用。该研究首次阐明了GPX3通过VDAC1-mtDNA-cGAS-STING轴调控肝细胞-巨噬细胞对话从而影响肝脏再生的新机制。

该研究发表于《Clinical and Translational Medicine》。为开展研究，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：1. 利用70%部分肝切除术小鼠模型和肝脏缺血-再灌注损伤模型研究肝脏再生；2. 运用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对再生肝组织进行细胞亚群和通路分析；3. 构建肝细胞特异性GPX3基因敲除和过表达小鼠模型；4. 采用免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱（MS）技术、免疫荧光共定位以及蛋白质截短/突变分析鉴定GPX3与VDAC1的相互作用；5. 应用多种线粒体功能检测试剂（如MitoSOX、JC-10、Rhod-2、Fluo-8）、Western blot、免疫组织化学、流式细胞术、qPCR及ELISA等技术进行多层次的机制验证。研究样本主要来源于野生型（WT）和GPX3基因修饰小鼠的原代肝细胞、肝脏组织以及门静脉栓塞（portal vein embolization, PVE）临床患者的肝组织。

研究结果部分详细如下：
GPX3在部分肝切除术后表达上调：研究人员首先分析了公共scRNA-seq数据集，发现PH术后肝细胞中细胞周期相关通路显著上调，而OXPHOS相关通路被抑制。在建立的70%PH模型中，RNA-seq和验证实验证实，GPX3在肝细胞中的表达于PH术后48-72小时显著上调，且该表达受HIF-1a诱导。在临床PVE样本中也观察到GPX3表达上调。这表明GPX3可能在肝脏再生中具有功能相关性。
肝细胞特异性GPX3缺失损害肝脏再生：研究人员构建了肝细胞特异性GPX3敲除小鼠（GPX3^fl/flAlb^Cre）。在70%PH模型中，与对照组相比，敲除小鼠存活率降低，肝体比恢复延迟，肝损伤加重。分子水平上，GPX3缺失导致肝细胞增殖标志物（Cyclin D1, Cyclin A2, Cyclin B1）和Ki67、PCNA、BrdU阳性细胞比例显著降低，表明GPX3缺失抑制了肝细胞增殖并延迟了肝脏再生。
GPX3在肝脏再生期间维持肝细胞线粒体功能：研究发现，PH术后肝细胞活性氧（ROS）水平升高，线粒体超氧化物产生增加。GPX3缺失显著加剧了这些氧化应激现象，并进一步损害了线粒体呼吸功能（耗氧率OCR降低），导致线粒体膜电位去极化和ATP产生减少。这些结果证明GPX3缺失导致了严重的肝细胞线粒体功能障碍。
GPX3缺失破坏肝细胞的线粒体质量控制（MQC）：研究人员检测了线粒体动力学和自噬。GPX3缺失导致分裂相关蛋白（DRP1, FIS1）上调，融合相关蛋白（MFN2, OPA1）下调，并引起线粒体形态碎片化（线粒体长度缩短，碎片化比例增加）。同时，GPX3缺失抑制了PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬（表现为Parkin, Atg5, Beclin-1, LC3B-II下调和P62积累）。这些结果表明GPX3缺失导致MQC失调。
GPX3直接与下游蛋白VDAC1相互作用：通过IP/MS结合MitoCarta3.0数据库分析，研究人员鉴定出VDAC1是GPX3的下游靶蛋白。Co-IP和免疫荧光实验证实了GPX3与VDAC1在过表达细胞和再生肝细胞原代培养中存在直接的相互作用和共定位。结构域分析表明GPX3的A2结构域（残基75-150）是其与VDAC1结合的关键区域。预测的结合位点突变（MUT2）有效破坏了两者的相互作用。
GPX3调控的VDAC1寡聚化破坏线粒体Ca2+稳态和MQC：研究人员发现GPX3缺失并不影响VDAC1的转录水平，但显著增强了其蛋白寡聚化。在表达GPX3或其结合缺陷突变体（MUT2）的细胞中，进一步证实GPX3通过直接结合抑制VDAC1寡聚化。GPX3缺失导致肝细胞线粒体Ca2+水平降低而胞质Ca2+水平升高，表明Ca2+区室化紊乱。使用VDAC1寡聚化抑制剂VBIT-4处理GPX3敲除小鼠，可恢复线粒体Ca2+水平并降低胞质Ca2+水平。这表明GPX3通过抑制VDAC1寡聚化来维持线粒体Ca2+稳态和MQC。
抑制VDAC1寡聚化可抵消肝细胞GPX3缺失在肝脏再生中的有害影响：在GPX3敲除小鼠PH模型中给予VBIT-4，能够恢复线粒体形态和功能（膜电位、OCR、ATP水平改善，ROS减少），并上调线粒体自噬标志物。同时，VBIT-4治疗显著恢复了被GPX3缺失抑制的肝细胞增殖（PCNA、Ki67阳性细胞增加，细胞周期蛋白表达恢复）。使用另一种VDAC1寡聚化抑制剂VBIT-12也得到了类似结果，证实GPX3通过抑制VDAC1寡聚化来维持MQC和线粒体功能，从而促进肝脏再生。
VDAC1寡聚化诱导肝细胞mtDNA释放并激活巨噬细胞中的cGAS-STING通路：研究人员发现，GPX3缺失导致肝细胞mtDNA释放增加。这些释放的mtDNA进一步激活了肝脏巨噬细胞（特别是单核细胞来源的巨噬细胞，MDMs）中的cGAS-STING通路（表现为cGAS, STING, p-TBK1, p-IRF3蛋白水平升高）。这导致巨噬细胞表型改变：促炎因子（IL-1β, TNF-α）分泌增加，而促再生因子HGF分泌减少。使用DNase I清除mtDNA或用VBIT-4抑制VDAC1寡聚化，均可减轻巨噬细胞STING通路的激活和表型改变。在GPX3敲除小鼠中沉默巨噬细胞STING，可挽救肝脏再生延迟并降低炎症因子水平。这表明GPX3缺失通过VDAC1寡聚化促进mtDNA释放，进而激活巨噬细胞STING通路，改变其功能表型，最终抑制肝脏再生。
肝细胞中GPX3过表达促进肝脏再生：研究人员通过AAV8载体在小鼠肝细胞中过表达GPX3。在PH模型中，GPX3过表达显著加速了肝体比的恢复，增强了肝细胞增殖（Ki67、PCNA阳性细胞增加，细胞周期蛋白表达上调），并改善了线粒体功能（膜电位恢复，ATP产生增加，ROS减少）。这突显了GPX3过表达在促进肝脏再生中的治疗益处。
肝细胞GPX3缺失延迟缺血-再灌注损伤后的肝脏再生：在HIRI模型中，GPX3表达在再灌注后第1天达到峰值。肝细胞特异性GPX3缺失显著加剧了HIRI引起的肝损伤（坏死面积扩大，血清ALT/AST水平更高且持续时间更长），抑制了肝细胞增殖（PCNA阳性率降低），并增加了促炎细胞因子的表达。这证明了肝细胞GPX3在HIRI后肝修复中的关键保护作用。

讨论部分总结如下：该研究首次揭示了GPX3在肝脏再生中维持线粒体稳态的必要性。虽然GPX3不是肝细胞中表达量最高的基因，但其在PH术后被诱导性上调，提示其在再生中的重要作用。肝细胞特异性GPX3缺失损害了线粒体功能，进而延迟肝脏再生。机制上，GPX3能通过其A2结构域直接结合VDAC1，导致VDAC1寡聚化下调，进而恢复最佳的线粒体Ca2+水平和改善MQC。GPX3过表达改善了肝细胞线粒体功能和肝脏再生。这些发现表明靶向肝细胞GPX3或MQC可能代表一种有前景的促进肝脏再生的方法。线粒体功能是决定再生能力的关键。该研究发现PH术后线粒体OXPHOS受损，与在大鼠肝脏再生早期OXPHOS受抑制的报道一致，提示再生过程中可能存在特定的调控机制以恢复线粒体功能。MQC通过控制线粒体分裂、融合、自噬和生物发生来维持线粒体稳态，新兴证据表明MQC与肝脏再生相关。GPX3是一个高度保守的谷胱甘肽过氧化物酶家族成员，以抗氧化特性和在多种癌症中的抑癌功能而闻名。近期研究也提示GPX3参与线粒体功能调控。然而，其在MQC中的作用尚不清楚。本研究发现GPX3缺失导致VDAC1寡聚化显著增加，从而破坏了MQC。机制上，GPX3主要通过A2结构域与VDAC1结合来抑制寡聚化。值得注意的是，在体外验证GPX3与VDAC1结合位点的实验中，使用了LPS来放大VDAC1寡聚化信号，以比较野生型GPX3与其结合缺陷突变体的调控效应。该方法并非旨在模拟肝脏再生微环境，未来研究需要开发更接近肝脏再生背景的体外模型。VDAC1是位于线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）的关键通道蛋白，在维持MQC中发挥核心作用。本研究证明PH术后GPX3缺失导致VDAC1寡聚化增强，进而破坏MQC。值得注意的是，使用VDAC1寡聚化抑制剂VBIT-4治疗恢复了线粒体形态、呼吸功能和再生标志物，进一步证实GPX3通过调控VDAC1寡聚化来调节肝脏再生。鉴于VBIT-4潜在的非特异性效应，研究人员进一步使用了另一种VDAC1寡聚化抑制剂VBIT-12，并得出了相同的结论。然而，药物抑制剂具有固有的局限性，需要进一步的遗传学表观遗传实验来建立GPX3与VDAC1之间的直接因果关系。尽管当前研究尚未使用催化失活突变体在遗传学上区分GPX3的酶活性和结构功能，但N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）处理的结果表明，GPX3的保护作用不能仅由其抗氧化活性来解释。在未来的研究中，计划进一步构建并系统评估催化失活GPX3突变体在肝脏再生模型中的作用，以更清晰地界定其酶活性和结构依赖性功能的相对贡献。Ca²⁺是调控MQC的关键信号分子。VDAC1构成了Ca²⁺跨线粒体膜流动的主要途径之一。由寡聚化引起的VDAC1功能障碍可能破坏线粒体与胞质区室之间Ca²⁺分布的平衡。有报道称，防止VDAC1寡聚化可以维持线粒体Ca²⁺稳态和MQC，从而改善脓毒症相关心肌损伤。在本研究中，GPX3缺失促进了VDAC1寡聚化，导致胞质Ca²⁺水平升高而线粒体Ca²⁺积累减少。进一步研究发现了MQC的变化。通过使用VBIT-4，发现由VDAC1寡聚化引起的异常Ca²⁺分布得以恢复。因此，研究人员推测异常的Ca²⁺分布是MQC被破坏的原因之一，尽管具体机制仍需进一步验证。巨噬细胞构成了肝脏中最大的非实质细胞群之一。它们与肝细胞的相互作用在调节肝脏再生中起着至关重要的作用。近期研究表明巨噬细胞利用肝细胞来源的谷氨酸促进肝脏再生。mtDNA作为线粒体功能障碍的产物，可以激活下游巨噬细胞中的cGAS-STING通路，正如该课题组先前的工作所证实的那样。此外，已知VDAC1寡聚化可促进mtDNA释放。因此，研究人员探讨了GPX3缺失是否通过促进VDAC1寡聚化来增加mtDNA释放，从而影响巨噬细胞表型。研究结果表明，GPX3缺失增强了肝细胞mtDNA释放。这随后激活了巨噬细胞中的cGAS-STING通路，最终改变了巨噬细胞功能。关键变化包括HGF分泌减少和促炎因子分泌增加。同时，STING通路激活增加了下游IFN-α和IFN-β水平。总体而言，这一级联反应导致了肝脏再生延迟。然而，巨噬细胞在肝脏再生中的作用是双重且复杂的。虽然库普弗细胞来源的IL-6被认为是再生的关键促进因子，但该研究观察到尽管巨噬细胞IL-6水平升高，但肝细胞增殖总体受到抑制。这种差异可能是由于实验时间点的差异或此处未进一步分析的巨噬细胞群体的异质性所致。其潜在机制需要进一步阐明。

研究结论部分翻译如下：总之，GPX3通过抑制VDAC1寡聚化来稳定线粒体Ca²⁺动态和线粒体质量控制（MQC），同时防止线粒体DNA（mtDNA）介导的巨噬细胞功能和表型改变，从而促进肝脏再生，这使其成为肝脏再生治疗的一个潜在靶点。