《MedComm》：Mapping Immunity With Cutting-Edge Spatial Biology and Tissue Cytometry Innovations
免疫系统在有序的组织结构中运行，细胞间的空间关系决定了免疫应答的性质与结局。过去十年间，基于蛋白质成像的空间技术彻底改变了研究人员在组织原位研究免疫应答的方式，实现了单细胞分辨率下蛋白质与转录本的高重数同步检测。在计算方法的推动下，尤其是组织图像细胞计量学的发展，这些方法已能够对细胞邻域、细胞间距离、共表达模式及组织结构等空间指标进行定量提取，这些指标正成为免疫功能、疾病诊断及预后评估的新一代空间生物标志物。本综述从基于成像的空间蛋白质组学与组织图像细胞计量学的视角，系统梳理了免疫学的研究进展，讨论了推动该领域转变的多重成像平台、染色策略及计算工具。研究人员综述了该技术在肿瘤免疫学、自身免疫与感染性疾病、免疫代谢、神经免疫学及移植免疫学等领域的应用，揭示出免疫组织并非随机分布，而是具有空间决定性，并直接与疾病结局相关联。最后，研究人员评估了当前方法的优势与局限，并展望了三维成像、人工智能驱动的空间分析及空间生物标志物的临床转化等未来发展方向。
1 引言
单细胞技术的革命通过解析基因组、转录组、蛋白质组等多分子层面的细胞身份，极大拓展了人类对生物学的认知，揭示了调控健康与疾病的分子机制。然而，空间背景这一关键维度长期缺失——细胞并非孤立存在，而是嵌入组织中，其功能受周围微环境的相互作用塑造。这一认识催生了空间生物学：即在原生组织背景下研究生物分子与细胞。过去十年，空间方法已发展为丰富的技术体系，最初以空间转录组学为主导，逐步扩展至全组学整合。这些技术主要依赖三大类检测手段：基于成像、基于测序及基于质谱的方法。其中，基于成像的空间转录组学与空间蛋白质组学（尤其是抗体介导的空间蛋白质组学）因建立在经典诊断组织病理学技术（如原位杂交、免疫组织化学及光学显微镜）基础上而备受关注。通过实现多靶标的同步原位检测（即多重或高重数检测），空间方法不仅能量化细胞组成，还能定量功能相关的空间生物标志物，包括细胞间距离、共表达、细胞互作、邻域组织及组织结构。随着技术成熟并逐步融入研究与临床流程，空间生物学已成为生物医学最具活力的前沿领域之一。
正如流式细胞术将细胞悬液数据转化为定量生物学见解，空间生物学同样需要针对组织的等效分析学科，组织图像细胞计量学应运而生，将多重成像数据转化为可解释、空间分辨且具有生物学意义的信息。在所有应用领域中，空间免疫学发展最为迅速，主要受肿瘤免疫微环境研究的推动。肿瘤免疫微环境具有高度异质性，单细胞技术虽已揭示其影响肿瘤侵袭、转移及治疗应答的机制，但空间分析首次实现了在组织结构中直接可视化和量化这些互作。值得注意的是，肿瘤免疫学研究中建立的空间框架并不局限于肿瘤学，还为多种病理背景下的免疫应答研究提供了范式。
当前领域的挑战正从生成空间数据转向将其解读并转化为生物学与临床知识，核心在于基于成像的空间生物学与数字病理学的日益融合，组织细胞计量学正逐步进入临床常规应用。尽管进展迅速，目前仍缺乏以空间免疫学为主线、整合完整分析周期的综合性综述。本综述围绕基于成像的空间生物学与组织图像细胞计量学的核心组成部分展开，以免疫学为轴心，首先解析技术格局及其对测量能力与尺度的定义，随后讨论组织图像细胞计量学的计算框架，并系统梳理该方法在不同疾病背景下的生物学应用，阐明空间框架如何揭示跨组织与跨条件的免疫应答共享组织原则，最后探讨限制领域发展的技术与分析障碍，以及将塑造下一阶段空间探索的前沿方向。
2 用于空间免疫分析的前沿技术
空间免疫分析依赖于一系列技术创新，涵盖靶标原位标记、可视化及信息提取、定量与解读的全链条。
2.1 探测空间景观：标记、检测与成像
组织染色技术是组织图像细胞计量学与空间生物学的基础，决定了蛋白质或转录本的标记与成像方式。现有方法均建立在常规显色免疫组织化学与RNA杂交技术之上。研究人员总结了空间生物学中主要的染色技术及其原理，包括蛋白质检测（如显色免疫组织化学、荧光免疫组织化学、酪胺信号放大、寡核苷酸条形码标记、成像质谱流式）与RNA检测（如荧光原位杂交、RNAscope、滚环扩增、组合条形码序贯杂交、分支探针杂交）。染色方法的改进（如酪胺信号放大、循环免疫荧光、多重误差稳健荧光原位杂交）显著提升了重数检测能力，已实现同一切片中数十种蛋白质或转录本的检测。早期研究已证实，整合多重免疫荧光染色、自动化扫描与先进图像细胞计量学，可直接在组织切片中进行复杂免疫表型分析。
目前，组织染色与图像细胞计量学技术已广泛应用于多种疾病的病理生物学研究，并形成多样化的商业平台生态系统，涵盖从多光谱成像系统到集自动化多重染色与成像于一体的全流程平台。后者多采用基于微流控的循环标记系统，依赖荧光显微镜与荧光团偶联抗体或寡核苷酸进行成像。为克服传统方法中荧光光谱重叠对标记数量的限制，PhenoImager HT等平台采用多光谱成像技术，结合液晶可调滤光片与光谱拆分算法，显著提升重数检测能力。此外，成像质谱流式采用金属偶联抗体，通过激光烧蚀与时间飞行质谱检测金属信号，从根本上消除了光谱重叠问题，根据像素点金属丰度重建图像，兼顾分辨率与重数检测能力。
2.2 从图像到洞见：用于空间分析的组织图像细胞计量学
多数空间生物学平台内置基本的图像处理功能，但仅局限于图像配准、拼接与对齐等技术特异性预处理，难以支持深度的生物学分析。研究人员通常依赖第三方软件或定制化流程（多基于R或Python）构建高级分析工作流。开源软件拥有活跃的用户社区与丰富的在线资源，支持灵活定制分析流程，但其质量控制依赖用户现场测试，缺乏正式验证，且模块化特性可能导致技术壁垒，限制重复性与可比性，不利于临床转化。商业软件则提供稳定性与合规性，但灵活性较低且成本较高。目前，成像空间蛋白质组学领域已逐步形成OME-TIFF等社区标准文件格式，而SpatialData等框架正致力于统一图像与分子数据的互操作结构。
组织图像细胞计量学软件的核心优势在于可提取广泛的细胞特征，从标记物表达、形态学到细胞间空间关系。空间指标的开发尤其具有变革性，能够定量评估组织结构与免疫组织，作为预测性空间生物标志物。例如，肿瘤免疫微环境空间评分通过五种生物标志物的空间分布，预测肝细胞癌患者术后5年复发风险。随着重数检测能力提升，单张图像可包含数百至数千种标记物，每个细胞成为具有高维生物学特征的数据点，需要专门的框架（如scverse生态工具集）处理高维统计复杂性，通过降维与聚类等方法将高维特征压缩至低维空间以揭示隐藏的模式。同时，直接在组织图像上可视化分析结果，有助于将计算结果与实际组织学背景交叉验证，直观的图形用户界面进一步促进了空间数据的探索与质量控制。
人工智能尤其是深度学习正日益融入组织细胞计量学与组织病理学，可自动化完成免疫细胞识别、生物标志物评分（如PD-L1）及三级淋巴结构识别等任务，甚至直接从常规苏木精-伊红或显色免疫组织化学图像中提取特征，预测细胞表型与区域分类，支持临床诊断。部分平台已开始集成人工智能模块，但高级工具多以代码仓库形式存在。与此同时，图像分析的社区标准化努力（如“光镜仪器与图像质量评估与可重复性”倡议、全球生物成像联盟推动的FAIR数据原则、时空组学联盟）正致力于构建数据生态系统，促进成像数据与其他组学模态的互联，全面理解免疫学及相关医学领域的细胞基础。
3 情境中的免疫：理解发病机制的空间应用
在癌症、结核病、类风湿关节炎等多种病理背景下，免疫应答具有空间结构而非弥散分布的特征已得到广泛证实。肉芽肿、血管周生态位、免疫排斥区及三级淋巴结构等并非偶然的组织学伴随现象，而是反映并调控局部免疫活性的有序组织结构。因此，细胞功能不能仅由表型推断，还受其组织内空间定位的调控。例如，位于肉芽肿核心与外周的巨噬细胞可能表达相似标记物，但因所处细胞互作、信号梯度与代谢约束不同，功能角色存在本质差异。空间分辨方法使这些关系可被定量，识别出跨组织与临床背景的疾病发病机制共有空间模式。
3.1 肿瘤免疫学
肿瘤免疫微环境是过去十年空间生物学最突出的应用领域。在免疫治疗时代，治疗成败取决于肿瘤与免疫细胞的动态互作，空间生物学提供了可视化、量化与解读这些关系的强大框架，其揭示的空间模式对治疗应答的预测价值可能优于现有生物标志物。肿瘤浸润淋巴细胞及其他细胞类型被组织为结构化的空间邻域，解析这些细胞群落的组成与状态有助于开发更具靶向性的免疫治疗策略。研究发现成纤维细胞中心生态位在10种癌症中保守存在，其与肿瘤、基质及免疫细胞的互作及不同空间排列与患者预后相关。空间分析还显示，非包膜型结直肠癌肝转移的免疫抑制微环境显著强于包膜型，凸显了组织结构与免疫背景对理解治疗应答的重要性。
CD8+T细胞是抗肿瘤免疫的核心驱动因素，空间生物学可明确其是否不仅存在且处于正确位置。研究表明，乳腺癌中CD8+T细胞与肿瘤细胞的接近程度与均匀分布度等比单纯数量更具预后价值。类似规律也见于肺癌等其他癌症，特定CD8+组织驻留记忆T细胞亚群与肿瘤细胞的互作随肿瘤进展动态减少，反映免疫逃逸。空间方法还可监测治疗后的免疫重塑，例如前列腺癌治疗性疫苗可在不同肿瘤区域诱导独特的T细胞浸润模式。肿瘤免疫学为空间生物学奠定了概念基础，证明免疫细胞可组织为功能架构并与结局相关，而这些规律（如T细胞被排斥于肿瘤核心外、成纤维细胞生态位调控免疫可及性、肿瘤-间质边界的预后权重）并非肿瘤特有，在炎症、感染及退行性疾病中亦存在类似结构，提示免疫组织的空间逻辑可能是组织生物学的普遍原则。
3.2 自身免疫与过敏性疾病
自身免疫与过敏性疾病源于免疫系统对自身抗原或无害环境刺激的异常反应，常涉及复杂的免疫-基质互作，具体病因尚未完全阐明。空间蛋白质组学为解析其微环境组织提供了新视角。
类风湿关节炎是一种慢性自身免疫病，以抗瓜氨酸蛋白自身抗体产生与滑膜炎症为特征。单细胞研究虽揭示了滑膜细胞异质性，但多基于解离组织，丢失了空间信息。空间研究显示，LYVE1+巨噬细胞亚群定位于血管周围，且在治疗后缓解期重现，提示其在维持组织稳态中的免疫调节作用；同时，血管周胶原蛋白VI被鉴定为调控关节炎免疫应答的关键结构与功能生态位。过敏性疾病的慢性炎症多由免疫-上皮及免疫-基质互作失调驱动，空间分析揭示过敏性炎症由有序的免疫生态位维持。例如，屋尘螨诱导的小鼠哮喘模型中，纵隔淋巴结内的IL-2富集生态位驱动迁移性CD4+T细胞分化，进而归巢至肺部维持过敏反应；肺内三级淋巴结构的形成则可能作为祖细胞生态位，持续补充过敏原特异性T细胞群体，维持慢性炎症。
3.3 感染性疾病
在原位绘制宿主-病原体互作图谱，可深入理解感染组织内免疫应答的演变及其对疾病进展的影响。
结核病仍是单一病原体导致死亡的首要原因，免疫细胞在肺部聚集成肉芽肿，但这些结构的功能异质性与演化尚不明确。多重成像揭示肉芽肿内及患者间存在显著的免疫多样性，“总细胞中心偏好指数”可量化免疫细胞在肉芽肿内的中心或外周聚集倾向，结合免疫细胞组成可将肉芽肿分层为不同的复发空间模式。COVID-19大流行加速了空间技术的应用，早期研究通过空间转录组学发现感染肺内干扰素驱动的基因表达呈异质性分布；成像质谱流式构建了首个肺空间图谱，显示组织结构破坏与广泛免疫浸润；多重免疫荧光直接将促炎细胞因子表达定位至肺泡巨噬细胞与上皮细胞。值得注意的是，同一患者的肠道与肺免疫微环境对比显示，肠道淋巴结构保存完好，而肺部淋巴结构被破坏，提示无法维持有序免疫结构可能是重症肺病的关键特征而非后果。HIV病毒在淋巴结、肠道或脑等组织储库中持续存在，空间分析显示B细胞滤泡内的局部免疫调节环境（滤泡辅助T细胞抑制CD8+细胞毒性活性）允许病毒储库持续存在，这种限制性细胞毒性接触的结构化组织逻辑与肿瘤免疫学中的CD8+T细胞排斥机制高度相似。
3.4 免疫代谢
免疫代谢领域探索免疫应答与代谢过程的动态关系，涵盖代谢疾病的系统性炎症到疾病期间免疫细胞的胞内代谢重编程。免疫功能的塑造不仅取决于哪些细胞存在，还取决于其空间位置与组织方式，而免疫细胞的代谢状态本身也具有空间决定性。肥胖是多种疾病的常见合并症，发炎脂肪组织的特征是形成冠状结构——巨噬细胞包围死亡或垂死脂肪细胞的组织学结构，类似于感染性疾病的肉芽肿。空间分辨分析揭示该结构内存在代谢谱不同的巨噬细胞亚群，其与局部成纤维细胞的互作决定组织是消退炎症还是进展为纤维化。肿瘤微环境不仅免疫异质，代谢也呈异质性，高重数成像面板纳入iNOS、GLUT1、IDO1、G6PD及柠檬酸合酶等代谢标记物，可表征不同的代谢生态位，低代谢活性与更高的调节性T细胞接近度及更差生存相关，提示肿瘤代谢塑造免疫浸润模式。目前，空间代谢组学仍滞后于空间转录组学与蛋白质组学，新兴研究正尝试整合成像质谱流式与质谱成像数据，在同一空间背景下同步捕获细胞表型与代谢功能。
3.5 神经免疫学
小胶质细胞是脑内组织驻留免疫细胞，在神经保护与神经炎症中发挥核心作用，与多发性硬化、帕金森病及阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关。高重数成像可区分多发性硬化病灶内的常驻小胶质细胞与招募的免疫细胞群体，并绘制其与病灶类型及活动的空间关系。阿尔茨海默病研究中，空间蛋白质组学显示小胶质细胞并非处于离散的“静息”或“激活”状态，而是跨越连续的免疫激活状态，由局部组织环境动态调控，并在病变区域向功能失调表型偏移；长期靠近β-淀粉样蛋白斑块会逐渐驱动小胶质细胞向功能失调状态转化。这些空间分辨的洞见提示，阿尔茨海默病的治疗策略不应局限于清除淀粉样蛋白，还需关注局部组织生态位内小胶质细胞的功能状态。随着中枢神经系统免疫活性被证实具有区域特异性，空间生物学为绘制基质、胶质细胞与免疫细胞互作提供了关键框架。
3.6 再生免疫学
除防御功能外，免疫系统日益被认为是组织修复与再生的核心协调者。急性心肌梗死研究中，观察到单核细胞招募集中于特定的心内膜枢纽，由局部上调的分子信号驱动，干扰该空间受限的招募会恶化心功能，证明免疫应答的空间组织可决定愈合结局。牙周健康状态下，中性粒细胞被空间限制在牙龈内以维持稳态，而在疾病状态下，中性粒细胞的浸润与扩散则提示炎症，这种空间限制可能是有效清除细菌并避免疾病进展的关键。目前，高维空间蛋白质组学在再生场景中的应用仍有限，这为明确免疫细胞定位与互作如何调控成功组织修复提供了重要机遇。
3.7 移植免疫学
同种异体移植会引发受体对供体组织的免疫识别，主要组织相容性复合体差异是核心触发因素，受体T细胞将其识别为外来物并激活级联反应，最终导致移植物排斥。由于排斥发生在移植物的解剖学背景下，对供体-受体界面的空间分析可深入揭示移植免疫病理学。肝移植研究中，整合单细胞、空间转录组学与多重免疫荧光发现，驱动排斥的移植相关T细胞并非弥散分布，而是集中在特定的组织生态位内。肾移植活检研究中，成像质谱流式结合人工智能分类器与空间指标，可根据免疫细胞在肾小球与小管的空间排列区分不同类型的排斥。将分子空间数据整合入传统的Banff分类系统，有望揭示排斥机制、提高诊断准确性、优化移植物监测与干预策略，最终推动实现长期免疫耐受。
4 空间免疫学的障碍与新路径
空间生物学在免疫学应用中的快速发展伴随着一系列未解决的技术与分析障碍，同时也涌现出有望重新定义原位免疫学认知的新机遇。
4.1 技术与分析障碍
样本制备、染色与抗体验证仍是主要瓶颈。尽管商业平台提供标准化方案，实际检测开发仍需大量优化，且经过充分验证的抗体种类有限，限制了抗体平台的panel设计；抗体或寡核苷酸探针的供应也可能随批次性能或商业变化波动，导致panel重新设计与验证。自定义panel虽可开发，但实验室间差异大，影响可重复性，因此研究人员公开详细的开放获取染色方案对促进透明性、可重复性与社区标准至关重要。
通量与重数之间存在权衡。基于成像的空间蛋白质组学虽具单细胞分辨率，但可检测标记物数量远低于基于测序的空间转录组学，这主要源于抗体检测固有的荧光光谱重叠问题，以及循环染色与检测导致的组织与抗原完整性逐渐丧失。未来染色化学与信号检测的改进有望提升重数，例如PRISM技术通过利用仅四个通道内的荧光强度梯度，在单轮成像中实现64重空间RNA检测，无需增加荧光通道或循环染色。
数据预处理、细胞分割与细胞注释是高噪声与技术偏差的主要来源，鲁棒的预处理步骤至关重要，但目前预处理流程仍缺乏标准化。细胞分割不准确（尤其在细胞密集或形状不规则区域）会严重偏倚下游分析，基于扩展细胞掩模与人工标记门控的金标准方法耗时且易错，深度学习已显著提升核与细胞分割的准确性与自动化水平，机器学习与深度学习方法也在开发中以克服传统细胞分型策略的局限，但尚未形成广泛采用的通用标准工具。
空间数据集体积巨大，单样本可超过100 GB，长期存储与可及性面临挑战。分析流程尚不统一，各实验室常使用不同或自研工具，且缺乏清晰的文档、实现细节与可用性标准，限制了可重复性与推广。同时，高维数据分析对计算资源要求极高，集成深度学习的流程尤其依赖高性能计算基础设施，资源有限地区的研究人员可能面临访问障碍。
多模态与多组学数据整合旨在捕获组织生物学的整体视图，部分商业平台已支持单次检测中整合蛋白质组与转录组数据，当数据来自同一组织样本的连续区域时，整合相对直接，已有算法框架与深度学习模型可实现空间层融合；但当数据来自不同样本或平台时，需校正生物学差异与平台特异性偏差，目前已有SpatialData等计算框架与深度学习模型应对这一挑战。
从实验室到临床的转化仍面临多重障碍。高重数技术虽已在临床试验中应用，但临床场景中最多实施的是10标记以内的多重免疫荧光panel，临床转化很可能依赖标记物精简策略以定义最小预测panel。在工作流程优化方面，从样本制备到数据解读的全流程需足够简化与可扩展，才能适应病理科的时间与工作负荷限制。此外，空间生物标志物的前瞻性验证面临独特的技术与监管挑战，不同于PD-L1等已有明确数学定义与FDA批准的伴随诊断标志物，空间生物标志物缺乏标准化定义与监管先例，需明确细胞间距离、组织分区边界及高阶空间统计等指标。Immunoscore是值得借鉴的中间案例，通过量化肿瘤核心与浸润缘两个区域的CD3+与CD8+T淋巴细胞密度预测结直肠癌复发风险，经多中心前瞻性验证后已在欧盟获CE-IVD认证并在FDA CLIA认证实验室常规使用，但其成功凸显了空间复杂生物标志物标准化的难度。成本也是重要考量，高重数空间检测的单样本研究成本仍较高，即便使用组织微阵列降低成本，仍存在部分标记物染色不可靠、阵列核心脱落等问题，影响数据完整性与可重复性。此外，荧光成像易受样本类型、染色伪影、成像条件或仪器变异的批次效应影响。
4.2 空间免疫学的新兴前沿
人工智能驱动的数据推断正取得令人振奋的进展，可从标准苏木精-伊红图像预测分子信息，例如ROSIE模型能从配对苏木精-伊红图像生成多重免疫荧光图像。但这类模型的性能受训练数据中标记物代表性影响，若某些标记物在训练数据中代表性不足或分布不均，会导致预测偏差，且模型受限于预定义模式，难以识别新型或罕见细胞群体，因此需要更大规模、更多样化且标注良好的多模态数据集提升泛化能力。
三维成像与超分辨技术正逐步突破二维切片的局限。目前多数三维成像通过对薄切片进行序贯染色与成像，再计算重建为体积表示；也有研究尝试增加切片厚度、结合组织透明化与光片荧光显微镜等技术，但尚未开发出能达到二维组织同等重数的免疫染色方法，且技术复杂性使其难以在常规组织病理学场景中规模化应用。超分辨方面，膨胀显微镜通过物理扩张组织提升分辨率，无需专用光学设备，已实现扩大组织中的23重染色。三维与超分辨成像仍处于早期阶段，但有望以前所未有的方式绘制组织与器官的空间图谱。
空间图谱是空间生物学革命最有前景的成果之一，正在构建人类健康与疾病组织的综合空间参考框架，可作为人工智能驱动数据推断的训练数据。三维成像与超分辨显微镜的持续发展将进一步提升这些图谱的空间保真度。
下一代组织图像细胞计量学正致力于分析流程的创新，包括集成人工智能驱动的图像分析解决方案。鉴于生物数据的固有异质性，实现全自动“一键式”分析仍具挑战，但以普及空间数据分析为目标，在组织图像细胞计量学软件中集成人工智能辅助界面（如交互式聊天机器人或引导式分析模块）以支持非专业用户并简化分析流程，是重要的未来方向。
面向空间组学的高级计算工具将持续涌现，以应对数据规模、分辨率与多模态复杂性的增长。例如SPLISOSM（空间异构体统计建模）可检测空间可变转录异构体，揭示仅测量总基因表达无法发现的空调控机制；NicheCompass则超越细胞类型的共定位，基于相邻细胞间的活跃信号事件识别组织生态位，揭示组织架构背后的通讯逻辑，而非仅描述“谁与谁相邻”。
5 总结
空间生物学重新定义了研究人员观察免疫应答的方式，为直接洞察免疫细胞如何在组织中组织、互作与行使功能提供了窗口。具体而言，基于成像的空间平台是可视化空间免疫活动的强大工具，本综述讨论的方法与技术为理解不同病理背景下的免疫学提供了重要洞见。尽管空间技术仍在成熟过程中，但已开始在诊断与疗法发现领域塑造未来。其在临床场景的整合将取决于解决当前在可扩展性、标准化、数据分析与成本方面的挑战。随着空间生物学的持续发展，它将推动免疫学、病理学及精准医学进入空间信息指导的新时代。
