黄素蛋白中光探测与射频波调控的自旋化学

《Nature Biotechnology》：Optically detected and radio wave-controlled spin chemistry in flavoproteins

　　

光寻址自旋系统已在量子传感应用中得到广泛研究。本研究中，研究人员证明在特定的黄素蛋白——隐花色素（Cryptochrome，Cry）和改进型光-氧-电压（Light-Oxygen-Voltage，LOV）蛋白（iLOV）中，光生自旋相关自由基对（Spin-Correlated Radical Pairs，SCRPs）可被射频波操纵。该能力使得利用射频脉冲和磁场梯度进行磁场传感与光致发光空间调控成为可能，将蛋白质确立为光寻址自旋系统和基于射频的生物学过程控制的平台。

固态自旋系统，如金刚石中的氮-空位（Nitrogen-Vacancy，NV）中心或六方氮化硼中的硼空位，是量子传感领域的核心工具。其自旋-光子界面使得光探测磁共振（Optically Detected Magnetic Resonance，ODMR）得以实现，并在生物学和物理学中拥有多种传感应用。尽管这类固态自旋系统具备诸多优势，但其光学与自旋特性的可合成调控性或确定性制备方法仍面临挑战。分子自旋系统提供了一种引人注目的替代方案，它具有自下而上设计的两大关键优势：一是可通过精确的原子级控制实现分子结构及其相关性质的可调控性；二是可通过化学组装实现可扩展性。近期，具有光学自旋界面的有机金属分子的合成已被证实。本研究发现，某些黄素蛋白也表现出光寻址自旋态。基因编码蛋白质支架的主要优势在于其生物相容性，以及通过合理设计或定向进化进行调控的潜力。

光活性黄素蛋白，例如隐花色素和LOV结构域蛋白，在响应蓝光时会产生涉及黄素辅因子和附近氨基酸残基的自旋相关自由基对。这些自由基对最初形成于特定的自旋相关单重态或三重态。这些态之间的自旋转换受到超精细相互作用的支配，并受外部磁场影响，从而可以调制重组动力学，并最终影响反应的光化学结果。在LOV蛋白中，这些SCRPs仅在天然反应被突变阻断时才形成，且不参与信号传导。然而，Crys被认为在磁感受中具有直接作用，例如使鸟类能够利用地磁场进行导航。

本研究证明这些蛋白在环境条件下表现出ODMR。在并行工作中，工程化的LOV蛋白（MagLOV）、红荧光蛋白-黄素系统以及荧光蛋白系统（后者不依赖于SCRPs）中的ODMR也已被报道。研究人员的互补性工作表明，基于自由基对的ODMR同样发生在典型的Cry和广泛应用于细胞成像的荧光报告基因iLOV中。

首先，研究人员测量了来自莱茵衣藻的动物样Cry（CraCry）的光致发光（Photoluminescence，PL）强度随施加磁场强度B₀（地磁场和15 mT）的变化。观察到PL强度受到磁场存在的影响，这一现象被称为磁场效应（Magnetic Field Effect，MFE）。该效应可归因于所形成SCRP的单重态-三重态转换受到调制，从而在给定的实验平衡条件下改变了不同黄素物种（主要是氧化态黄素）的浓度。研究中同样纳入了iLOV蛋白，这是一种已被优化用作细胞成像荧光标记的结构域。类似地，研究人员也观察到了MFE，尽管对比度更高，且该效应依赖于激光激发功率。在两种情况下，负的MFE（即施加磁场后PL降低）均表明自由基对起源于三重态。虽然这与LOV蛋白的特性一致，但与关于Cry的已有数据相矛盾，后者表明自由基对起源于单重态。这暗示在本研究的实验条件下，可能形成了替代性的自由基对。

虽然MFE之前已被详细研究，但这些发现启发研究人员进行了类似于固态自旋对应物的ODMR实验。在这些实验中，射频或微波频率用于寻址与光学跃迁耦合的自旋跃迁，而这些跃迁的信号可以从PL强度中读出。因此，研究人员开发了一个改进的ODMR装置，该装置包括温控样品处理、可调磁场B₀以及用于射频传输的电子设备，并结合了灵敏的PL检测。典型的ODMR脉冲序列为：施加特定的射频，同时记录PL强度。为消除噪声（如激光强度波动），另有一次不施加射频脉冲的参考测量。通常ODMR实验保持磁场恒定而扫描射频频率，但本研究避免了这种方法，因为射频传输结构的频率相关特性可能导致共振线型的不必要调制。因此，研究人员保持射频固定而扫描磁场强度。实验中使用先前表征过的氮化硼纳米管（Boron Nitride Nanotubes，BNNTs）中的固态自旋系统（S=1/2）来校准磁场强度。

首先，研究人员施加1,470 MHz的射频，将磁场从42.5 mT扫描到62 mT，并监测CraCry样品的PL强度。在约52.5 mT处观察到PL强度增强，这对应于自由电子预期的自旋跃迁。约100 MHz的线宽与超精细相互作用预期的线宽吻合良好。为验证信号确实源自电子自旋共振，研究人员在不同射频频率下激发CraCry样品，并在每种情况下扫描磁场强度。ODMR共振频率的移动与g≈2的自旋系统一致，证实观察到的是电子自旋共振。

接下来，研究人员对iLOV进行了ODMR实验。观察到的ODMR信号在定性上与CraCry相似，但在优化后实现了近50%的惊人对比度。在该情况下，同样确认了g≈2的自旋系统。值得注意的是，与CraCry相比，iLOV在亮度和稳定性方面有显著提升。iLOV的线宽（约70 MHz）比CraCry（约100 MHz）略窄，且与¹⁵N标记无关。PL光谱表明在射频激发下氧化态黄素单核苷酸（Oxidized Flavin Mononucleotide，FMN_ox）状态增加。重要的是，信号随时间逐渐建立，这表明与MFE类似，ODMR对比度源于射频驱动下黄素状态化学平衡的缓慢转变。动力学过程受光学激发和射频功率以及其他影响化学平衡的因素支配。这一观察结果最合理的解释是形成了长寿命态，例如通过氧化还原或质子化反应产生，随后在毫秒至秒的时间尺度上衰变。尽管这些态在光激发后布居可能很弱，但在连续光和射频激发条件下，它们的积累导致了显著的ODMR对比度。此外，研究人员还进行了脉冲ODMR实验，其中光学激发和射频操作在时间上被分离。这些测量结果证明，在瞬态吸收实验中观察到的黄素三重态寿命期间，射频操作是可行的，而这也是SCRPs形成的时间尺度。所有这些观察都指向SCRP机制作为所观察到的ODMR效应的暂定解释。在MFE实验中，施加的磁场分裂了三重态，改变了自由基对的重组动力学，最终在连续光激发下影响了基态黄素分子的平衡浓度。施加的射频场诱导了T₀与T₊/T_-三重态之间的自旋跃迁，从而逆转了MFE，导致PL强度增加。

需要注意的是，ODMR也可能直接源于三重态。然而，这种机制通常不会产生毫秒至秒时间尺度的长寿命态，更重要的是，预期会在GHz范围内产生显著的零场分裂，而这在本研究数据中并未观察到。

在蛋白质中检测到ODMR的能力开辟了广泛的应用前景。与固态系统中的光活性缺陷类似，自旋共振可用于磁场传感。由于其卓越的ODMR性能、高亮度、稳健性、紧凑尺寸以及适用于生物技术应用的特点，iLOV被选用于后续实验。为演示这一点，研究人员将一块小磁铁放置在样品旁边，在显微镜视场中产生磁场梯度。与先前的ODMR实验不同，通过分析每个相机像素上记录的光谱来保留空间信息。由此产生的ODMR共振频率在视场中的移动反映了局部磁场的变化。在这些实验中，研究人员记录ODMR随射频的变化。尽管ODMR信号的详细线型和结构受射频传输的影响，但研究者通过经验发现，对ODMR对比度进行加权可以提取平均共振频率，这可作为磁场的可靠校准指标。将此拟合方法逐像素应用，即可构建出磁场分布图，可视化样品上的梯度。研究人员使用BNNT固态自旋系统验证了磁场梯度。该技术为基于遗传编码的自旋化学磁场传感提供了一条有前景的途径，是对量子钻石显微镜（其传感与生物样品之间的距离常受限）的一种补充方法。

最后，射频控制与磁场梯度的结合实现了对蛋白质中SCRP的空间控制。类似于磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）中使用的技术，磁场梯度B(x)允许根据关系式f=γB(x)将位置编码为共振频率，其中γ是电子的旋磁比。通过施加特定的射频f_RF，只有满足该共振条件的区域或“片层”中的SCRPs会被选择性激发。这种由射频脉冲实现的局部激发改变了该位置的自由基重组产率，从而改变了PL。通过计算施加射频（RF on）与不施加射频（RF off）时的PL比率，实现了PL空间控制的可视化，如图3e中不同频率f_RF下的所示。通过调节射频，可以选择性地寻址特定区域的蛋白质，其空间分辨率由施加的磁场梯度强度决定。

调制蛋白质PL强度的能力可以提高灵敏度（例如通过抑制背景PL），或实现超分辨技术，其中空间分辨率被编码在磁场梯度中，从而超越光学分辨率的限制。更重要的是，本研究结果证明黄素状态的（光）化学过程可以利用射频场进行控制——这是与固态自旋缺陷的关键区别，后者的ODMR响应受光物理过程支配。这为未来利用射频控制生物学过程，如基因表达或信号传导，铺平了道路。

总而言之，研究人员证明了CraCry和iLOV蛋白中的自旋态可以在环境温度下用射频场进行操作并光学读出。蛋白质通过合理设计或定向进化所固有的可调控性，为工程化自旋-光学界面提供了令人兴奋的机遇。由于其高光学对比度、亮度和稳定性，研究人员预期iLOV将在量子技术、生物成像和射频控制的生物化学领域找到广泛应用。