双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）和动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）外多糖的生产与分析：基因组基础、结构及益生元特性

《Process Biochemistry》：Production and analysis of exopolysaccharides from Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium animalis subsp. lactis: genomic basis, structure, and prebiotic properties

　　

Nanyu Tang|Tao Lin|Chang Xu|Xia Fan|Kai Ma|Changliang Zhang|Shuo Geng|Feng Ji|Xin Rui|Wei Li

南京农业大学三亚研究院，食品科学与技术学院，南京，江苏210095，中国

摘要

本研究探讨了来自Bifidobacterium bifidum 3469（BBF-EPS）和B. animalis subsp. lactis 9749（BAL-EPS）的外多糖（EPS）的产生及其益生元特性。为了消除传统MRS-c培养基中存在的外源性多糖的干扰，使用了一种不含复杂碳水化合物成分的改良培养基（MRS-TY）来生产EPS，从而能够准确表征其内在合成的结构。全基因组测序显示这两种菌株的EPS生物合成基因簇存在根本性差异。B. bifidum 3469的紧凑基因簇产生的EPS较为简单（分子量为1.98×10^5 Da，由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖以1.00:0.78:0.34:0.25的摩尔比组成），而B. animalis subsp. lactis 9749的大型复杂基因簇产生的EPS富含半乳糖（分子量为2.02×10^5 Da，由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖以5.47:1.46:1.00:0.86的摩尔比组成）。这两种EPS均能促进Lactobacillus菌株的生长。体外粪便发酵实验表明，BBF-EPS富集了Megamonas和Faecalibacterium，导致丙酸产量增加（51.77 mM）；相比之下，BAL-EPS富集了Bifidobacterium和Blautia，增强了丁酸的产量（28.67 mM）。这些发现强调了优化培养基对于可靠表征双歧杆菌EPS的重要性，支持其作为肠道健康靶向益生元的潜在应用。

引言

人类肠道微生物群是一个复杂的生态系统，在影响营养、代谢和免疫系统方面发挥着关键作用[1]、[2]。在该微生物群中，Bifidobacterium属被认为是人类肠道微生物群中最主要的菌株之一，尤其是在婴儿体内，并被视为健康肠道系统的重要指标[3]。双歧杆菌的益生元效应归因于多种机制，其中生物活性代谢物的产生是其对宿主健康有益作用的主要媒介。这些代谢物中的一类是外多糖（EPS），它们被认为是促进宿主-微生物相互作用的关键功能性分子[4]。EPS为细菌提供了重要的生态优势，帮助它们抵抗环境压力、促进生物膜形成并增强对黏膜表面的附着[5]、[6]。对于宿主而言，EPS具有益生元效应、免疫调节和抗氧化特性等潜在益处[7]、[8]。EPS的生物活性与其独特的化学结构密切相关，这些结构由产生菌株的遗传组成决定，并可能因物种和培养条件的不同而有所差异。

双歧杆菌通常需要复杂且营养丰富的培养基才能良好生长。传统的培养基，如Demann、Rogosa和Sharp（MRS）培养基，含有较高的外源性多糖含量[9]。这些培养基中的多糖会在提取过程中与细菌合成的EPS共同沉淀，从而干扰后续的结构分析，并混淆其结构和功能特性之间的关联。因此，使用不含多糖的明确培养基对于准确阐明不同双歧杆菌菌株的固有结构特征至关重要。此外，EPS的结构多样性和其相应的功能特异性主要由菌株特异性的eps基因簇决定，该基因簇控制着糖核苷酸前体的组装、聚合、链长确定以及最终多糖的分泌[10]。不同的双歧杆菌物种和菌株在这些基因簇的组成和排列上可能存在显著差异[11]。比较基因组分析表明，即使在亲缘关系密切的菌株之间，eps基因簇中的功能相关基因也存在差异，这表明EPS生物合成途径存在变异。双歧杆菌EPS对肠道微生物群的调节作用具有益生元样效果；然而，这些功能的结构特异性及其在物种间的保守性仍需进一步阐明。因此，系统比较不同双歧杆菌物种的EPS的遗传学、结构和功能是非常必要的。

本研究调查了产生EPS的Bifidobacterium bifidum 3469和B. animalis subsp. lactis 9749菌株。通过全基因组测序和分析，阐明了两种菌株的糖核苷酸合成途径及eps基因簇的差异，并分析了不同生长阶段eps生物合成基因的转录变化。进一步比较了在不含多糖的培养基和标准MRS培养基中产生的EPS的结构特征，包括单糖组成、分子量（Mw）以及通过一维¹H核磁共振光谱（NMR）进行的结构分析。最后，通过纯培养发酵（与人源乳酸菌）和模拟人体肠道微生物群发酵评估了双歧杆菌EPS的体外益生元潜力。本研究系统地将两种不同双歧杆菌物种的EPS的遗传基础和结构特征与其独特的益生元功能联系起来，为其作为功能性食品成分的应用提供了新的见解。

章节摘录

细菌菌株和试剂

B. bifidum 3469和B. animalis subsp. lactis 9749是从纯母乳喂养婴儿的粪便中分离得到的，并在MRS培养基中（含有0.1%（w/v）L-半胱氨酸盐酸盐）于37℃的厌氧条件下（85% N₂、5% CO₂、10% H₂）进行培养。Ligilactobacillus salivarius S-21、Lactobacilllus gasseri G-83、L. crispatus C-3、Limosilactobacillus reuteri R-1、Lacticaseibacillus rhamnosus RH-68和L. paracasei P-92也是从纯母乳喂养婴儿的粪便中分离得到的

B. bifidum 3469和B. animalis subsp. lactis 9749的完整基因组序列仅包含一个环状染色体，未检测到质粒。B. bifidum 3469的基因组大小为2.34 Mb，GC含量为62.8%；而B. animalis subsp. lactis 9749的基因组大小为1.94 Mb，GC含量为60.49%（图1A和表S2）。这些基因组特征符合Bifidobacterium属的已知范围[16]。与较大的基因组大小一致，B.

结论

本研究全面分析了B. bifidum 3469（BBF-EPS）和B. animalis subsp. lactis 9749（BAL-EPS）产生的EPS，揭示了遗传决定因素与不同结构之间的联系，并最终阐明了它们独特的益生元功能。BBF-EPS来源于一个紧凑的基因簇，具有较简单的结构；而BAL-EPS由一个大型复杂的操纵子编码，具有富含半乳糖的复杂结构。这些关键差异

Chang Xu：监督、资源提供。Tao Lin：方法学、研究、正式分析。Kai Ma：验证。Xia Fan：监督、资源提供。Wei Li：项目管理、资金获取、概念构思。Xin Rui：写作——审稿与编辑。Nanyu Tang：写作——初稿撰写、可视化、数据管理。Changliang Zhang：验证。Feng Ji：数据管理。Shuo Geng：写作——审稿与编辑。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

本研究得到了国家自然科学基金（编号32572551和32372311）、中央高校基本科研业务费（编号CXCYL2026004）和江苏省高等教育机构重点学术发展计划（PAPD）的共同资助。