《Talanta Open》：Equivalence of Droplet Digital PCR and Quantitative PCR in the Molecular Quantification of Shougong for the Quality Control of Jinlong Capsule
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近年来，分子定量已成为中成药中动物源性中药材质量控制的一种极具前景的策略。本研究开发并验证了基于微滴数字PCR（ddPCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）的新型分子检测方法，用于定性定量分析金龙胶囊（JLC）中的多疣壁虎（守宫）。研究人员设计了一套针对细胞色
近年来，分子定量已成为中成药中动物源性中药材质量控制的一种极具前景的策略。本研究开发并验证了基于微滴数字PCR（ddPCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）的新型分子检测方法，用于定性定量分析金龙胶囊（JLC）中的多疣壁虎（守宫）。研究人员设计了一套针对细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因的物种特异性引物探针组合，该组合对守宫表现出高度特异性。两种方法均表现出良好的线性，其中ddPCR灵敏度更高（检测限：0.79 copies/μL），而qPCR具有更宽的线性范围。利用实验室制备的JLC样品对建立的ddPCR和qPCR方法进行了严格验证，显示出优异的线性、特异性、效率和可靠性，随后成功应用于10批市售批次以检测守宫特异性扩增子。ddPCR与qPCR的结果高度相关（Spearman r = 0.9171, p < 0.05），且在Bland-Altman分析中表现出强一致性，尽管两种方法的批间精密度差异显著（qPCR相对标准偏差[RSD]为2.01%；ddPCR变异系数[CV]为20.66%）。总之，qPCR和ddPCR是互补而非可互换的：当重现性至关重要时推荐使用qPCR，而ddPCR则有利于降解或痕量水平样品的绝对定量。方法的选择应依据具体的应用场景和实验室要求。
金龙胶囊作为首个获批采用新鲜动物药材制备的抗肿瘤中成药，其质量控制长期面临挑战。传统化学标志物法难以应对动物药成分复杂且缺乏特异性标记物的现状，而现有的分子检测手段在复杂基质中的灵敏度与准确性仍有待提升。为此，研究人员开展了基于微滴数字PCR（ddPCR）与实时荧光定量PCR（qPCR）的分子定量技术研究，旨在解决守宫成分的精准鉴别与定量难题。该研究不仅证实了DNA片段在成药中的可追溯性，还确立了两种技术在中药质控领域的互补地位，对保障临床用药安全意义重大。
在技术方法层面，研究人员采用了多项关键技术。样本队列涵盖了多疣壁虎及其常见混伪品，以及按标准配比人工模拟的金龙胶囊样本和10批市售成品。核心技术包括：基于改良甲醇结合吸附柱法的高效DNA提取技术，克服了中成药复杂基质的抑制干扰；靶向线粒体COI基因设计并筛选高特异性引物探针体系；分别构建qPCR标准曲线与ddPCR微滴分区扩增体系；应用相关性分析与Bland-Altman一致性检验进行统计学比对。
关于研究结果，具体内容如下：
引物与探针的特异性验证显示，针对COI基因设计的引物探针组在qPCR与ddPCR体系中均表现出极高的物种特异性，能准确区分守宫与其近缘混伪品，无非特异性交叉反应。
分析灵敏度与线性范围评估表明，qPCR的灵敏度（检测限）为34.2 copies/μL，线性范围跨越9个数量级，测定系数达0.9997；ddPCR的检测限低至0.79 copies/μL，展现出更优越的灵敏度，但在高浓度模板下动态范围较窄。
特异性、重复性、稳定性及回收率实验证实，qPCR的批内与批间精密度变异系数（RSD）分别为0.32%至2.23%和2.01%，24小时内DNA稳定性良好，平均加标回收率为98.91%。ddPCR的平均加标回收率为88.62%，虽在可接受范围内，但其批间精密度变异系数（CV）高达20.66%，稳定性也略逊于qPCR。
自制样本中守宫投料量的测定结果显示，随着自制样本中守宫比例从100%递减至20%，qPCR与ddPCR测得的DNA拷贝数均呈梯度下降，且拷贝数比与理论投料质量比高度吻合，证明DNA定量可有效反映原始投料量。
商业金龙胶囊样本的应用显示，在10批市售样本中，qPCR测得的守宫成分拷贝数为2.39×102至4.60×102 copies/mg，ddPCR为2.29×102至4.54×102 copies/mg。相关性分析得出Spearman相关系数为0.9171（p < 0.05），Bland-Altman分析所有数据点均落在95%一致性界限内，证明两种方法结果具有极强的相关性。
在讨论与结论部分，研究人员指出，优化的DNA提取方法是复杂中成药分子定量的前提。qPCR凭借极低的批间变异系数（2.01%）和较低的仪器成本，适用于对重现性要求极高的常规质控场景；ddPCR虽然精密度较低，但具备免标准曲线的绝对定量能力和更高的灵敏度（0.79 copies/μL），在处理降解严重或痕量DNA的复杂样本时优势明显。两者并非替代关系，而是互为补充。研究人员建议，当追求高通量、低成本和高重现性时应首选qPCR；而在进行微量掺假鉴定或高度降解DNA的绝对定量时，ddPCR则是更强大的工具。这项研究为含动物药中成药的分子质量控制提供了标准化的技术路径与理论依据。
