《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：N-glycome composition of extracellular vesicles released by urological cancer cells and reference non-malignant cells
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通过细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）运输生物活性分子是细胞间通讯的机制之一。EVs调节受体细胞的多种生理过程，但也参与多种疾病（包括癌症）的发生和发展。许多糖蛋白被整合到EVs中，但其生物学意义尚不清楚。糖基化可以影响蛋白质
通过细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）运输生物活性分子是细胞间通讯的机制之一。EVs调节受体细胞的多种生理过程，但也参与多种疾病（包括癌症）的发生和发展。许多糖蛋白被整合到EVs中，但其生物学意义尚不清楚。糖基化可以影响蛋白质分选进入EVs的过程，并调节EVs与靶细胞的相互作用。因此，正在研究EV糖组在诊断和治疗中的潜在应用。本研究旨在利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）对泌尿系统癌细胞系（膀胱癌-T24、前列腺癌-PC-3、肾癌-Caki-2）及其对应的非转化细胞系（分别为HCV-29、HPrEC和HREpC细胞）释放的EVs进行结构分析，并鉴定可区分它们的N-聚糖（N-glycans）。与非转化细胞来源的EVs相比，所有癌细胞系来源的EVs均显示出寡甘露糖型（oligomannose）结构丰度增加。特别地，在所有3种癌细胞系来源的EVs中均观察到H8N2、H9N2和H10N2结构的表达增加。此外，癌细胞来源EVs的总体唾液酸化（sialylation）程度降低，H5N4E2、H6N5E1L2和H6N5E2L1结构的表达量减少。此外，研究人员还鉴定了可区分每种泌尿系统癌细胞系来源的EVs与参考非恶性细胞来源的EVs的特异性结构/结构亚群。这些结果为泌尿系统癌细胞来源EVs中存在的N-聚糖的结构多样性和生物学意义提供了初步见解。识别出与所研究泌尿系统癌症共有或特异的EVs N-聚糖富集或缺失模式，可能有助于开发新的诊断方法。
泌尿系统癌症（包括膀胱癌、前列腺癌和肾癌）在全球范围内发病率及死亡率高企，亟需深入探究其病理机制并开发新的诊疗策略。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的重要载体，其携带的蛋白质、核酸等分子可能成为新型生物标志物。EVs继承了亲本细胞膜的N-聚糖蛋白和多样化的N-糖基化谱，而异常N-糖基化是恶性肿瘤的普遍特征，影响肿瘤细胞的迁移、黏附及免疫逃逸等过程。目前，关于EVs的N-糖组组成及其在泌尿系统癌症中的诊断潜力研究尚不充分。因此，研究人员选取了三种主要泌尿系统癌症（膀胱癌、前列腺癌、肾癌）的恶性细胞系（T24、PC-3、Caki-2）及其对应的非恶性参考细胞系（HCV-29、HPrEC、HREpC），旨在验证这些细胞释放的EVs在N-糖组组成上存在差异的假设。该研究通过系统比较癌症与非恶性细胞来源EVs的N-聚糖谱，为理解癌症相关EVs的生物学特性及寻找潜在的糖基化诊断标志物提供了基础。该研究成果发表在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》期刊上。
为完成此项研究，研究人员首先建立了六种细胞系的体外培养体系，并采用基于低真空过滤和超速离心的方案从无血清培养上清中分离EVs。通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析和蛋白质免疫印迹法对分离得到的EVs进行了形态、粒径分布和标志蛋白（CD63, Hsp70, Arf6）的表征。随后，利用MALDI-TOF MS技术对EVs裂解物经肽-N-糖苷酶F（PNGase F）酶切释放的N-聚糖进行了分析。N-聚糖在质谱分析前经过唾液酸衍生化处理，并通过固相萃取进行纯化。数据采用GlycoWorkbench软件进行谱图解析和结构注释，并利用统计学方法比较不同来源EVs间N-聚糖丰度的差异。
研究结果如下：首先，研究人员成功分离并表征了六种细胞系来源的EVs，证实其纯度与代表性。在膀胱癌细胞研究方面，对T24细胞来源EVs与HCV-29细胞来源EVs的N-聚糖组分析显示，T24来源的EVs中寡甘露糖型结构（如H8N2、H9N2、H10N2）丰度显著增加，同时总唾液酸化程度降低，特别是α2,6-连接的唾液酸（SA）含量下降，而岩藻糖基化（fucosylation）和α2,3-连接的SA丰度升高。在肾癌细胞研究中，Caki-2细胞来源的EVs同样表现出寡甘露糖型结构（H8N2、H9N2、H10N2）的富集，以及总唾液酸化和杂合型N-聚糖丰度的降低。在前列腺癌细胞研究中，PC-3细胞来源的EVs亦显示出寡甘露糖型结构（H5N2、H8N2、H9N2、H10N2）和多种岩藻糖基化复合型结构的增加，同时含有α2,3-和α2,6-连接的SA的结构以及仅含α2,6-连接的SA的结构丰度普遍降低。最后，对三种癌细胞来源EVs的N-聚糖谱进行横向比较发现，寡甘露糖型结构的增加是共性特征，而H8N2、H9N2和H10N2结构在三种癌细胞系来源的EVs中均呈现上调趋势。此外，不同癌细胞来源的EVs之间在特定N-聚糖结构的丰度上也存在差异。
讨论部分指出，研究揭示的EVs N-糖基化改变（如寡甘露糖结构增加和总体唾液酸化降低）可能反映了恶性转化细胞中糖基化加工途径的异常（如内质网和高尔基体功能失调），并可能影响EVs与免疫细胞的相互作用（如通过甘露糖结合凝集素）及生物分布。这些糖基化特征与从患者生物流体（如尿液）中分离的EVs所呈现的模式有时存在差异，这可能归因于患者样本中EVs来源的异质性（包含肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞等）、EVs释放和分选的动态过程以及肿瘤进展阶段的影响。细胞系来源的EVs为机制研究提供了可控模型，而生物流体来源的EVs则更适合于临床转化研究和生物标志物发现。总之，EVs的N-糖组不仅是潜在的非侵入性生物标志物，也可能在肿瘤微环境、转移、免疫调节中发挥功能性作用。
结论部分总结道，N-糖基化的改变是公认的癌症标志。EVs表面携带N-糖蛋白，其糖基化状态不仅是亲本细胞的被动反映，还可能参与EVs的分选、摄取和靶向。尽管泌尿系统癌症的细胞/组织N-糖基化常表现出β1,6-分支、唾液酸化和岩藻糖基化的经典变化，但EVs的N-糖基化模式可能有所不同。本研究证实，某些特征（如寡甘露糖含量）在癌症EVs中增强，而其他特征（如总体唾液酸化）则减弱，表明EVs的N-糖基化不仅是潜在的生物标志物，还可能对EVs的功能（如归巢、免疫调节）产生机制性影响。未来，需要在泌尿系统癌症中开展更多高通量EVs N-糖组学和N-糖蛋白质组学研究，并深入探究特定N-聚糖改变在EVs生物学中的具体作用，同时推动EV分离和N-聚糖分析流程的标准化。
