经多巴胺修饰的Ti3C2Tx MXene材料在耳蜗类器官培养中能够促进支持细胞的多能性及毛细胞的再生

《Biomaterials》：Dopamine-modified Ti3C2Tx MXene Promotes Supporting Cell Pluripotency and Hair Cell Regeneration in Cochlear Organoid Culture

张艳|孟世贤|马欣|李琳|张婉玉|张新媛|乔瑞峰|宣颖颖|胡琴|马慧|王英辉|刘星宇|马晓燕|孙建斌|薛阳|孙白|寇波|张淼|李晓军

太原科技大学化学工程与技术学院，中国太原 030024

摘要

感音神经性听力损失（SNHL）主要是由于耳蜗毛细胞的不可逆损伤所致，目前仍是一个没有有效治疗方法的临床难题。最近，基于二维纳米材料的神经调节策略显示出再生潜力，其中MXene材料因其优异的电导率、生物相容性和可修饰的表面特性而备受关注。毛细胞（HCs）和支持细胞（SCs）源自相同的感觉前体细胞，先前的研究表明，在耳蜗类器官培养中加入MXene（尤其是Ti₃C₂T_x）可以促进毛细胞与支持细胞的形成。然而，MXene容易氧化，在毛细胞再生过程中会失去其在Matrigel中的导电性和催化活性。在本研究中，我们用多巴胺（DA-MXene）对MXene进行了改性，以模拟神经递质的功能，从而促进毛细胞的再生。我们发现，与未经改性的MXene相比，DA-MXene显著增强了支持细胞在类器官培养中的增殖和存活能力。在DA-MXene处理的耳蜗组织培养中，毛细胞的形成也得到了提升。机制研究表明，DA-MXene进一步激活了调控干细胞多能性的信号通路，这对于恢复支持细胞的可塑性至关重要。总体而言，这项工作提出了一种结合化学修饰和电活性刺激的创新纳米材料方法，为SNHL的毛细胞再生提供了有前景的策略。

引言

听觉过程始于声波进入外耳道，引起鼓膜和耳蜗内淋巴液的振动，进而导致毛细胞（HCs）相对于盖膜发生相对空间位移[1]。毛细胞是听觉的感受器，能够将机械信号转化为生物信号并传递到听觉皮层[2]。支持细胞（SCs）和毛细胞来源于相同的祖细胞，在鸟类和鱼类等非哺乳动物中，支持细胞能够自发再生毛细胞，但在人类和小鼠等哺乳动物中，支持细胞在出生后很快就会失去再生毛细胞的能力[3]。耳蜗毛细胞的损伤是感音神经性耳聋的主要原因，目前尚无FDA批准的药物治疗方法[4]。支持细胞的重编程和毛细胞的再生是治疗感音神经性听力损失的主要策略。先前的研究表明，通过调控耳蜗器官中支持细胞的Notch和Wnt信号通路，新生小鼠能够再生毛细胞[5]。此外，利用Lgr5阳性的支持细胞，也可以通过三维（3D）类器官培养在体外高效生成毛细胞[6]。然而，所有这些研究都局限于新生儿阶段，因为哺乳动物出生后支持细胞的可塑性会显著下降[7]、[8]。

在成年阶段，毛细胞的再生仍然是一个挑战，目前在这一阶段尚未实现功能性毛细胞的形成，因此无法通过毛细胞再生来恢复听力。为了解决这个问题，近年来许多研究团队通过优化培养条件[5]、调控关键信号通路[8]、[10]以及引入新的生物材料取得了重要进展。相关研究表明，在类器官培养系统中添加新的生物材料（如MXene-Matrigel系统）可以促进耳蜗支持细胞向毛细胞的转化[6]。MXene是一类新型的二维（2D）过渡金属碳化物、氮化物或碳氮化物材料，具有独特的电化学、机械和表面特性，在能量存储、电磁屏蔽、传感和生物医学领域展现出巨大潜力[12]、[13]、[14]。然而，用于MXene合成的氢氟酸（HF）或含氟蚀刻剂（如LiF+HCl）具有高度腐蚀性[15]，对环境和操作安全构成威胁，而且MXene（尤其是Ti₃C₂T_x）在水中或潮湿空气中容易氧化，形成TiO₂，从而降低其导电性和催化活性[16]。

多巴胺（DA）作为一种重要的神经递质，在内耳和其他组织的再生过程中发挥着复杂多样的作用[17]。Wnt/β-连环蛋白的激活可以促进耳蜗毛细胞的再生[18]，而在Pakingson病模型中，DA受体的激活可以通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路来促进海马神经发生[19]。为了确定DA是否能够改善MXene的生物界面性能，我们在MXene表面附着了一层多巴胺。结果显示，DA改性的MXene在空气或水溶液中的稳定性、分散性、细胞相容性和细胞粘附性均得到了显著提升[20]。不过，DA是否能够激活毛细胞的再生还有待进一步研究。

在本研究中，我们通过将不同浓度的DA改性MXene加入Matrigel中，开发了一种三维水凝胶培养系统。首先评估了这种复合材料的生物相容性，发现由DA-MXene和Matrigel组成的水凝胶比未经改性的MXene-Matrigel具有更好的生物相容性。这种复合水凝胶显著增强了耳蜗支持细胞的存活能力和增殖能力。此外，DA-MXene-Matrigel在耳蜗组织培养和类器官培养模型中都显著促进了毛细胞的形成。机制研究表明，与未经改性的MXene相比，DA-MXene通过增强支持细胞的多能性进一步促进了毛细胞的形成。在我们的共培养系统中，DA-MXene-Matrigel在促进毛细胞形成方面优于MXene-Matrigel，展示了一种基于纳米材料的新方法来治疗感音神经性听力损失。这种策略结合了化学修饰和电刺激的优点，具有广阔的临床应用前景。

章节摘录

多巴胺-MXene（DA-MXene）的特性

单层Ti₃C₂T_x MXene是通过选择性蚀刻Ti₃AlC₂ MAX相中的Al层原子，然后采用传统的低强度层剥离（MILD）方法进行离子插层和剥离制备的[21]。如图1A所示，合成的Ti₃C₂T_x MXene仅显示6.56°（2θ）的002衍射峰，这对应于层间距；原始MAX相中的（101）、（104）和（105）衍射峰均已消失

讨论

像MXene、聚吡咯和石墨烯这样的导电材料在组织再生中的应用引起了广泛关注，尽管其背后的机制尚未完全明了[55]。这些材料被认为可以促进电信号传导、模拟生物电微环境、促进细胞间通信，并支持神经元和心肌细胞等电活性组织的功能恢复[56]。在此背景下，

Ti₃C₂T_x MXene的合成

Ti₃C₂T_x MXene是通过选择性蚀刻Ti₃AlC₂ MAX相中的Al层原子，然后采用传统的低强度层剥离（MILD）方法进行离子插层和剥离制备的。通常，向20 mL的9 M HCl中加入1.6 g的LiF，随后缓慢加入1 g的Ti₃AlC₂。在35°C下反应36小时后，用去离子水洗涤产物并离心至上清液呈中性。然后对混合物进行15分钟的超声处理

CRediT作者贡献声明

马慧：项目指导。王英辉：项目管理。刘星宇：数据分析。张艳：项目指导。马晓燕：项目管理、方法学研究、概念构思。李晓军：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、资金获取、数据管理、概念构思。胡琴：项目管理。张淼：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、资金获取

数据可用性

RNA-seq数据已存入Gene Expression Omnibus数据仓库，访问号为：GSE317059。支持本研究所有发现的数据均包含在主论文及其补充信息中。本研究提供了原始数据。

作者声明没有竞争性财务利益。

资助

本研究得到了中国陕西省自然科学基础研究计划（项目编号2024JC-ZDXM-43）、国家自然科学基金（编号32570978）以及中央高校的基本研究经费（资助对象为李晓军）的支持。

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

我们感谢李实验室的成员在整个研究过程中提供的帮助和建议。本研究得到了国家自然科学基金（项目编号32570978）以及中央高校的基本研究经费（资助对象为李晓军）的支持。