一种基于纳米抗体的简单且广泛适用的策略以生成强效TNFR激动剂

《Cell Death & Disease》：A simple and broadly applicable nanobody-based approach to generate potent TNFR agonists

　　

肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族（TNFRSF）的受体在科学和临床上具有极其重要的意义，是基础与转化研究的热点。TNFRSF受体（TNFR）可被TNF超家族（TNFSF）的膜结合配体结合，在某些情况下，也可被从膜结合型TNFSF配体（TNFL）分子上释放的可溶性配体分子结合。开发基于重组TNFL的TNFR激动剂用于研究，特别是治疗目的，是高度“个体化”的，因为在稳定性、可生产性、TNFR特异性和寡聚化需求方面，必须克服配体类型特异性的障碍。TNFR特异性抗体也可能表现出激动活性，但这种激动性通常依赖于Fcγ受体（FcγR）结合，从而导致一种相互条件性的双特异性FcγR/TNFR激动作用，这不利于研究或利用纯粹的TNFR激动作用。一些抗体能够触发不依赖FcγR结合的内在TNFR激动作用，但由于同种型和表位要求，且与FcγR结合的抗TNFR抗体相比比活性较低，此类抗体的合理开发难以预测且充满挑战。研究人员使用一系列针对TNFRSF成员41BB、BCMA、CD40、CD95、TRAILR2/DR5、GITR、OX40、TNFR1和TNFR2的纳米抗体（或单域抗体（sdAbs）或重链可变区结构域（VHHs））表明，将这些纳米抗体的单链编码三聚体与寡聚化蛋白支架进行基因融合，通常可产生强效的六价、九价和十二价激动剂，其诱导TNFR信号传导的半数最大效应浓度（EC₅₀）值在亚纳摩尔范围内。所描述的寡价纳米抗体格式表现出卓越的理化性质（CMC）特性，使得从几乎任何TNFR特异性纳米抗体简单生成高活性的TNFR激动剂成为可能。

**论文解读：基于纳米抗体的通用型TNFR激动剂构建策略及其优异性能**

**研究背景与问题**
肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族（TNFRSF）在免疫调节、细胞分化和存活中发挥核心作用，其成员是治疗自身炎症性疾病、心脏病和癌症的重要靶点。开发强效且具有内在活性的TNFR激动剂面临重大挑战。现有方法主要分为两类：基于配体（TNFL）的激动剂和基于抗体的激动剂，但两者均存在显著局限性。基于TNFL的激动剂开发是高度“个体化”的过程，需要针对不同配体类型解决稳定性、可生产性、受体特异性以及寡聚化需求等多重障碍。许多可溶性TNFL三聚体本身激动活性很弱或没有活性，需要通过工程化手段稳定其三聚体结构或进行多聚化。基于抗体的激动剂虽然规避了部分配体缺陷，但二价抗体通常难以有效诱导受体聚集，需要依赖FcγR结合或交叉连接才能发挥激动作用，这引入了非特异性的FcγR激活信号，干扰了对纯粹TNFR激动机制的研究。即使是能够触发FcγR非依赖性内在激动作用的双特异性抗体，其开发也缺乏普适性且充满挑战。因此，迫切需要一种简单、通用且高效的方法，能够从几乎任何TNFR特异性识别元件出发，快速构建出具有强内在活性和良好药学性质的TNFR激动剂。

**研究开展与主要发现**
研究人员提出并验证了一种创新策略：利用识别特定TNFR的单域抗体（纳米抗体，Nb）作为构建模块，通过将其基因编码的三聚体（3xNb）与不同的寡聚化蛋白支架融合，生成多价（六价、九价、十二价）的Nb-TNFR融合蛋白。研究首先证实，传统的二价Nb-Fc融合蛋白对多数TNFR几乎没有或只有很弱的内在激动活性，其活性高度依赖于FcγR的结合。然而，当将Nb三聚体与不同的寡聚化结构域融合后，所生成的多价融合蛋白（3xNb:TNFR-Fc(DANA)、3xNb:TNFR-TNC、3xNb:TNFR-GCN4）对多种TNFR（包括41BB、BCMA、CD40、CD95、GITR、OX40、TNFR1、TNFR2、TRAILR2等）展现出强大的、浓度依赖性的内在激动活性，其EC₅₀值普遍达到亚纳摩尔甚至皮摩尔水平。重要的是，这些多价Nb激动剂的活性普遍优于或至少相当于商业化的或实验室内部开发的基于配体的基准激动剂（如MegaCD40L、MegaCD95L、Fc-OX40L等）。在细胞实验和原代人T细胞实验中，这些多价Nb激动剂能够有效激活经典的NF-κB通路（以IL-8/CXCL8或MCP-1产生为标志）、替代NF-κB通路（以p100加工为p52为标志），并诱导细胞死亡（包括依赖Caspase-8的凋亡和依赖RIPK3的坏死性凋亡）。在功能层面，靶向GITR和TNFR2的多价Nb激动剂能显著扩增人调节性T细胞（Treg），靶向OX40和GITR的激动剂能有效共刺激常规T细胞。该策略具有高度的通用性，研究人员筛选了针对不同类别TNFR（包括仅含一个富含半胱氨酸结构域（CRD）的BCMA、不同数量CRD的死亡受体以及TRAF相互作用受体）的多种纳米抗体，发现无论其是否阻断配体结合，将其改造为多价格式后均能获得强效激动剂。此外，这些多价Nb融合蛋白表现出良好的生产可扩展性、热稳定性（在60°C孵育1小时或长期37°C孵育后活性损失小）和低聚集倾向（凝胶过滤分析显示主要为正确组装的单体峰）。纯化后的蛋白质仍保持高激动活性，证实其活性并非由随机聚集引起。最后，该研究还揭示了TNFR激活可能的一个共同机制：对多价Nb激动剂而言，空间上无序地诱导六个或更多个TNFR分子的邻近聚集，足以触发受体激活，而无需高度有序或结构复杂的组装过程。

**关键技术方法**
本研究采用的核心技术方法包括：1）通过骆驼科动物免疫和噬菌体展示技术，筛选和制备针对多种人及小鼠TNFR胞外域的特异性纳米抗体。2）利用分子克隆技术，构建了系列表达载体，用于在HEK293T细胞中瞬时表达二价（Nb-Fc）及多价（3xNb与Fc(DANA)、TNC或GCN4结构域融合）的纳米抗体融合蛋白。3）采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子（人IL-8、小鼠MCP-1）分泌作为TNFR激活读出；通过细胞活力测定（如结晶紫染色、MTT法）评估死亡受体激活；通过流式细胞术分析细胞表面标志物（如ICAM-1、FoxP3）表达；通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测信号通路关键蛋白（如Caspase-3、PARP、p100/p52、TRAF1）的活化。4）运用抗Flag或ALFA标签的亲和层析技术纯化目标融合蛋白，并通过高效液相色谱（HPLC）凝胶过滤分析其纯度和组装状态。5）使用商业化的基于配体的激动剂作为基准，在相同实验体系中对多价Nb激动剂进行活性对标比较。6）从维也纳大学医院获取的白细胞去除系统（LRS）血样中分离人外周血单核细胞（PBMC），用于T细胞功能分析。

**研究结果分述**

* **二价TNFR靶向纳米抗体融合蛋白基本无激动性或激动性微弱**
研究人员构建了一系列靶向不同TNFR的二价Nb-Fc融合蛋白。实验发现，在缺乏FcγR共表达的情况下，这些二价融合蛋白即使在高浓度下也几乎不能诱导IL-8产生。只有当它们与表达FcγRIA的HEK293细胞共培养时，其诱导IL-8的能力才被显著增强，EC₅₀值降低数个数量级。这表明二价Nb-Fc融合蛋白本身缺乏内在激动活性，其活性完全依赖于FcγR的结合，行为与传统的抗TNFR二价IgG抗体相似。

* **多价Nb:TNFR融合蛋白展现强内在激动性**
为解决二价格式的局限性，研究人员将Nb三聚体（3xNb:TNFR）与三种寡聚化结构域融合：人IgG1 Fc结构域（引入DANA突变以减少FcγR结合）生成六价格式，纤连蛋白C（TNC）三聚化结构域生成九价格式，以及酵母转录因子GCN4的四聚化亮氨酸拉链生成十二价格式。这些多价融合蛋白在HEK293T细胞中表达良好，且大小符合预期。功能评估显示，除靶向41BB的构建体外，所有其他靶向多种TNFR的多价构建体均能高效诱导IL-8或MCP-1产生，其EC₅₀值普遍在1-10 ng/mL（约10-100 pM）范围内。对于靶向死亡受体（如CD95）的构建体，十二价格式（3xNb:CD95-GCN4）的EC₅₀值甚至低于10 pg/mL（亚皮摩尔级）。与基准配体激动剂相比，多数多价Nb构建体展现出相等或更高的“比活性”。此外，这些多价Nb融合蛋白在热稳定性方面也表现优异，优于部分Fc融合的配体激动剂。

* **纯化与基准对比验证活性真实性**
为排除蛋白质聚集对活性评估的潜在影响，研究人员对部分多价Nb融合蛋白进行了亲和纯化。纯化后的蛋白质通过SDS-PAGE显示高纯度，凝胶过滤分析证实其主要以正确组装的单体形式存在，无显著聚集。关键的是，纯化后的多价Nb激动剂在功能实验中保留了与未纯化上清液相当的高激动活性。与商业化的基准激动剂（如MegaCD40L、MegaTNF、Fc-OX40L等）并排比较，多价Nb激动剂在最大效应和EC₅₀方面表现优异。例如，十二价的3xNb:CD95-GCN4诱导半数最大细胞杀伤所需的浓度比MegaCD95L和Fc-CD95L低一个数量级以上。Western Blot分析进一步证实，3xNb:CD95-GCN4能更有效地激活Caspase-8，并更有效地诱导CD95死亡诱导信号复合物（DISC）的形成。针对小鼠CD95的多价构建体也表现出类似优势。

* **激活替代NF-κB通路和坏死性凋亡途径**
研究进一步验证了多价Nb激动剂激活多种TNFR相关信号通路的能力。使用靶向GITR、OX40和CD40的多价Nb构建体刺激相应细胞，通过Western Blot检测到p100 NF-κB前体蛋白向p52的加工以及TRAF1的上调，这标志着替代NF-κB通路的激活。该激活强度远高于相应的配体基准激动剂。在靶向CD95死亡受体时，使用无法进行Caspase-8依赖性凋亡但可进行RIPK3依赖性坏死性凋亡的HeLa细胞系进行实验，发现3xNb:CD95-GCN4能有效诱导细胞死亡，且该死亡可被坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1阻断，但不受Caspase-8抑制剂影响，证实其能诱导坏死性凋亡。

* **有效刺激人原代T细胞功能**
为在更具生理相关性的模型中验证活性，研究人员测试了多价Nb激动剂对人原代T细胞的作用。在高密度PBMC培养体系中，靶向GITR和TNFR2的多价Nb激动剂能显著增加CD4⁺FoxP3⁺调节性T细胞（Treg）的频率，而配体基准激动剂（如GITRL-His、TNF）在此条件下无效。在抗CD3/CD28珠刺激的常规T细胞共刺激实验中，靶向OX40的3xNb:OX40-GCN4能显著增强ICAM-1的表达，而其配体基准Fc-OX40L则无效，再次证明了多价Nb格式优越的激动活性。

**讨论部分总结**
该研究成功建立了一种基于纳米抗体的通用平台技术，用于高效制备强效的TNFR激动剂。相较于传统配体或抗体激动剂，此方法具有显著优势：1）通用性强，可适用于多种类型和功能的TNFR，克服了配体和抗体开发的个体化瓶颈；2）设计简单，只需将靶向同一受体的纳米抗体三聚体与标准寡聚化结构域融合，即可从无活性或低活性的二价前体快速生成高活性激动剂；3）活性卓越，所得多价激动剂在EC₅₀和最大效应上普遍优于现有配体基准，且不受FcγR干扰；4）理化性质优越，继承了纳米抗体稳定性好、易于生产、不易聚集的特点。研究结果强调，诱导多个（≥6个）TNFR分子的空间邻近是实现高效受体激活的充分且关键事件，这为理解TNFR信号传导的分子机制提供了新见解。该平台技术的建立为TNFR靶向的免疫疗法和基础研究提供了强有力的工具。

**研究结论**
综上所述，研究人员开发了一种简单且广泛适用的策略，通过将靶向TNFR的纳米抗体三聚体与寡聚化蛋白支架融合，生成具有亚纳摩尔活性、高稳定性且无FcγR依赖性的多价（六价、九价、十二价）TNFR激动剂。该方法有效克服了现有基于配体和抗体激动剂开发的复杂性和局限性，为快速制备针对广泛TNFR成员的强效激动剂提供了可靠途径。