《Ecology and Evolution》：Maximizing the Quality of Non-Invasive Samples for Conservation Genetics Using Targeted Next-Generation Sequencing: A Comparison of Fecal DNA Preservation Methodologies
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非侵入性粪便DNA采样为野生动物研究、管理和保护提供了强有力的工具。然而，获取高质量和高数量的粪便DNA是出了名的困难，受许多不同变量的影响。可以说，在生物学家可控范围内，最具影响力的因素是样本在送至实验室分析前的收集和储存方式。本研究旨在比较不同的粪便DNA
非侵入性粪便DNA采样为野生动物研究、管理和保护提供了强有力的工具。然而，获取高质量和高数量的粪便DNA是出了名的困难，受许多不同变量的影响。可以说，在生物学家可控范围内，最具影响力的因素是样本在送至实验室分析前的收集和储存方式。本研究旨在比较不同的粪便DNA保存方法在靶向基因分型方法中的表现，并提高提取DNA的质量和数量，以更好地指导野外粪便采样。研究人员评估了七种不同粪便DNA保存方法在新鲜考拉（Phascolarctos cinereus）粪便样本中导致的单核苷酸多态性（SNP）缺失数据比例。所有保存方法均成功获取了DNA；然而，通过裂解振荡（即清洗）方法获得了最佳的DNA回收率，其产量几乎等同于更具侵入性的高质量组织样本。研究结果表明，将裂解缓冲液和清洗技术与粪便靶向基因分型相结合具有显著优势。由于稳健的采样方法是成功数据分析的基础，这种优化的粪便采样技术可以进一步增强研究人员解决种群生态学、保护遗传学和种群管理中的关键问题的能力，并有助于实施改进的保护策略和决策。
**研究背景与意义**
非侵入性粪便采样及其遗传分析在野生动物研究、管理和保护中的应用日益广泛，已成为研究野生动物极具价值的工具。这种方法无需捕捉或处理任何动物，即可用于估计种群数量、有效种群大小、性别比例、亲缘关系、家域、栖息地利用、遗传多样性、基因流动、饮食、父权和交配策略以及社会结构。尽管粪便遗传学的非侵入性特点具有广泛吸引力，但其应用常因处理样本进行DNA提取及后续分析时面临挑战而受到限制，这主要是由于宿主DNA回收率低。粪便DNA提取和扩增的成功率高度受环境因素（如温度、湿度、日晒）和饮食的影响，同时也受更可控的因素如样本年龄（即在环境中暴露的时间）和储存/样本保存方法的影响。尽管许多研究试图改善粪便DNA基因分型结果，但由于影响成功的变量众多，先前为其他物种或不同气候/环境开发的技术可能对新研究的适用性有限。
在众多影响粪便DNA获取成功的变量中，对大多数野外生物学家而言，最具影响力且可控的因素是如何在样本运送至实验室前进行收集和储存。因此，已有几项研究评估了多种保存方法（如储存在乙醇、裂解缓冲液、DET缓冲液、硅胶中，干燥、冷冻）在多个物种（如犬科、象科、猫科、有袋类、鼬科、灵长类、有蹄类和熊科）中的相对成功率。遗憾的是，这些研究往往得出不一致的结论，即使在测试相似保存剂的情况下也是如此。这种不一致性凸显出最佳方法因物种以及其他可能的变量（如气候）而异。因此，许多研究者建议迫切且持续需要进行研究，以严格比较常用的储存类型。
加剧了以往研究结论混合现状的是，目前所有对粪便DNA保存方法的评估都是使用微卫星和聚合酶链式反应（PCR）分析进行的。研究尚未评估保存方法对使用单核苷酸多态性（SNP）基因分型时的影响。这令人惊讶，因为使用SNP的保护和种群遗传学研究激增，特别是那些源自非侵入性样本（如鳞片、毛发和粪便）DNA的SNP研究。此外，粪便DNA保存方法与靶向SNP基因分型之间的关系——后者有望更好地回收降解DNA——将引起研究者的极大兴趣，以识别能进一步改善基因分型结果的方法。
本研究的目标是从一组先前描述的选项中，使用靶向基因分型方法（DArTCap）确定最佳的粪便DNA保存方法，从而为野外粪便采样提供指导。研究人员使用了考拉的粪便，考拉是一种隐蔽的、树栖的有袋类动物，在澳大利亚东海岸呈斑块状分布，其大部分栖息地最近被列为濒危。尽管过去20年做出了保护努力，但昆士兰和新南威尔士州的考拉数量持续下降，地方种群灭绝成为现实的可能性。尽管有少数关于有袋类粪便DNA保存有效性的研究，但迄今为止尚无研究比较考拉的保存方法，也未使用靶向基因分型方法。因此，为前沿技术确定非侵入性样本的稳健保存方法至关重要，以确保在关键的保护和管理举措中使用的粪便DNA质量最大化。研究人员定量比较了七种干燥和液体方法保存考拉粪便DNA的有效性。通过实验设置，他们评估了（1）标准粪便刮取、（2）风干、（3）通风、（4）乙醇、（5）裂解缓冲液、（6）裂解缓冲液振荡（即清洗）和（7）拭子法。他们将这些保存方法的缺失SNP数据（即缺失的SNP）与作为高质量样本的组织样本的缺失率进行比较，以使用靶向方法（DArTCap）对各种粪便DNA SNP基因分型保存方法的有效性进行排序。
**研究方法**
研究团队于2020年至2021年间，对11只来自昆士兰州东南部吉姆皮地区的野生考拉（6雌5雄）进行了兽医检查。在检查期间（麻醉下），通过标准的耳标打孔采集了每只考拉的耳组织活检样本。所有活检样本均储存在RNAlater中，并置于?20°C冰箱直至处理。
从同一11只考拉的运输笼中收集了7份新鲜粪便。丢弃了看起来潮湿或压碎的粪便。在排泄后2小时内，使用七种不同的粪便DNA保存方法之一对粪便进行采样。七种方法包括：标准法（无额外处理）、风干法（在受控实验室风干48小时）、通风法（用网盖替换管盖以通风）、乙醇法（置于800 μL 95%乙醇中）、裂解法（置于800 μL裂解缓冲液中）、裂解振荡法（置于800 μL裂解缓冲液中并振荡清洗表面，仅保留洗涤液）和拭子法（用干拭子刮取粪便表面）。所有液体保存方法均使用800 μL体积以反映所用DNA提取试剂盒的方案。处理后的样本立即储存在?20°C冰箱中，并在一个月内完成DNA提取。
组织DNA提取使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒，按制造商方案操作，并在蛋白酶K消化后于56°C孵育过夜。粪便DNA提取使用QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒，方案略有修改：在加入裂解缓冲液后，样本在65°C孵育1小时，然后以最大速度涡旋振荡7分钟。DNA洗脱后浓缩至50 μL。
所有样本（共N=88）均使用DArTCap技术进行SNP基因分型。该技术结合了复杂性降低方法和下一代测序平台，并使用了基于东南昆士兰考拉DNA设计的考拉特异性捕获探针，旨在获取约2000个SNP标记。
数据分析方面，研究人员计算了所有样本的缺失数据比例（即未获得基因型呼叫的SNP标记）。使用R软件中的lme4包运行了二项式广义线性混合模型（GLMM），以个体ID作为随机效应，确定粪便保存方法是否影响SNP结果中的缺失数据比例。最终使用了负二项误差结构的GLMM分析原始SNP缺失数据，并将活检样本设为参照水平进行比较。
**研究结果**
所有样本均成功基因分型并纳入分析。个体样本的缺失SNP数据比例存在差异（范围=13%–99%，平均=43%）。在考虑个体身份后，除了裂解振荡法外，所有非侵入性粪便保存方法的表现均显著劣于活检样本（p < 0.001）。具体而言，裂解振荡法在减少缺失SNP方面优于其他方法，且与高质量的活检样本相比无显著差异（p = 0.351），其基因型匹配度平均达到98.35%。乙醇保存法和拭子法的平均缺失率（35%）次之，而裂解法（55%）、风干法（59%）、通风法（64%）和标准法（64%）的缺失率均较高，且个体间差异大。
**讨论与结论**
本研究是首次使用捕获探针基因分型方法评估非侵入性样本的粪便保存方法，同时也是首次评估考拉粪便的保存方法。重要的是，研究确定了一种简单直接的保存方法——裂解振荡法，它能优化粪便SNP基因分型的成功率，效果几乎与高质量的组织样本相当，这在以前使用其他方法时未曾证明。这些结果突显了靶向下一代基因方法（如DArTCap）在结合稳健的保存方法时的潜在威力，并鼓励为其他物种进行进一步优化。
研究结果显示，除了裂解振荡法外，每种粪便DNA保存方法在与活检组织DNA相比时表现差异显著。活检样本仍为遗传数据质量的金标准。表现最佳的裂解振荡法，其SNP缺失百分比仅略高于活检法，这一结果有些出人意料，因为先前使用裂解缓冲液提取粪便DNA的研究效果较差。本研究与这些研究的区别可能在于采用了清洗技术，这可能有助于获得更洁净的含有大量肠上皮细胞的上清液，从而提升DNA质量。乙醇保存法和拭子法的表现居中，但拭子法在新鲜粪便样本中似乎相当有效。表现最差的方法是单纯裂解法、风干法、通风法和标准刮取法，其中标准刮取法缺失率最高，尽管它此前被广泛使用和推荐。
靶向基因分型方法（如DArTCap）可能允许根据所使用的粪便DNA保存方法回收更多数据。由于先前研究均基于传统PCR分析，未来理想的情况是使用靶向基因分型方法重复这些研究。靶向方法可能为粪便DNA提供更稳健的基因分型方案，甚至达到接近高质量组织样本的标准，尽管需要在其他物种中进一步验证。技术进步（如DArTCap中探针设计改进了对低浓度DNA的捕获和测序）使其比鸟枪法等方法更适合处理降解DNA。
最后，本研究也存在一些局限性。结果仅针对宿主遗传分析，裂解振荡法对其他DNA分子工作（如饮食分析或病原体检测）的有效性尚不明确。研究使用了新鲜（<2小时）且未接触土壤、昆虫或环境因素的粪便，而在实际野外条件下这些因素可能影响DNA降解。此外，如果粪便在处理前先冷冻，裂解振荡法的效果是否依然可靠也需要进一步测试。
**结论**：理解特定物种使用靶向基因分型的最佳粪便DNA保存方法对于改善保护成果和做出明智决策至关重要。研究结果表明，裂解振荡（即清洗）粪便保存方法结合靶向基因分型，几乎能像高质量组织样本一样有效地回收考拉DNA。虽然结果特异于考拉，但可能也适用于其他草食性有袋类动物。该研究指南应有助于推动使用非侵入性粪便DNA技术的研究和管理工作中的野外采集及保存方案的发展。非侵入性采样的粪便可提供获取种群动态（如性别比、出生率、死亡率、迁入率、迁出率）、遗传多样性和栖息地利用估算的有力工具。此外，这些数据可用于更好地指导规划和环境影响评估过程，界定进化显著单元，并改进当前和未来种群的遗传管理（包括动物易地保护）。
