《Epilepsia》：High incidence of Y-chromosome mosaicism in male and female individuals with mild malformation of cortical development with oligodendroglial hyperplasia in epilepsy
目的：癫痫相关轻度皮层发育不良伴少突胶质细胞增生症（MOGHE）是一种认识不足的儿科皮层病变，约50%的个体与体细胞X连锁SLC35A2变体相关。在未检出SLC35A2突变的个体中，其遗传病因仍不明确，这限制了对其病理机制和临床特征的理解。本研究旨在鉴定缺乏致病性SLC35A2变体的MOGHE个体的遗传相关性，并研究其临床病理和基因组学关联。
方法：研究人员对29例（19例男性，10例女性）经组织病理学确诊的MOGHE患者的存档脑组织进行了研究。其中20例携带SLC35A2变体，9例在SLC35A2或其他癫痫相关基因中未检出突变。分析样本采用了DNA甲基化衍生的拷贝数变异（CNV）分析、聚合酶链反应（PCR）和发色团/荧光原位杂交（ISH）。
结果：CNV分析在10例女性中的5例（50%）中识别出Y染色体物质，并在19例男性中的16例（84%）中识别出嵌合性Y染色体增益，这些结果通过PCR和ISH得到证实，并与病变组织相关。根据SLC35A2状态和Y染色体增益对该队列进行探索性分层显示，在同时携带SLC35A2突变和Y染色体增益的患者中，有癫痫发作年龄更早、多脑叶受累和认知功能损害的趋势；然而，在这一小样本队列中，这些差异未达到统计学显著性。
意义：Y染色体物质在女性中的存在、男性中嵌合性Y染色体增益以及SLC35A2变体的共同出现，构成了MOGHE患者中一种重复出现的基因组特征。这些发现表明，性染色体异常可能参与了这种癫痫相关皮层畸形的病理生物学过程，强调了需要阐明这一临床-病理实体背后潜在的分子机制。尽管脑体细胞Y染色体增益的根本原因、生物学后果和临床意义仍有待进一步阐明，但研究结果确定了MOGHE中一个先前未被认识的基因组特征，并为未来在MOGHE队列中的研究提供了依据。
在29例MOGHE患者中，84%的男性和50%的女性中发现了脑体细胞嵌合性Y染色体增益。根据Y染色体增益和SLC35A2状态对队列进行分层，在MOGHE中划分出三个分子亚组。同时具有SLC35A2变体和Y染色体增益的个体表现出更严重（尽管在统计学上不显著）的临床病程。MOGHE的诊断组合应包括SLC35A2和Y染色体检测，以在未来临床实践和研究中细化病变特征。
1 引言
癫痫相关轻度皮层发育不良伴少突胶质细胞增生症（mild malformation of cortical development with oligodendglial hyperplasia in epilepsy, MOGHE）是一种与药物难治性癫痫相关的未被充分认识的脑病变。该病变最常见于幼儿，通常位于额叶，手术切除仍然是控制癫痫发作的主要治疗方法。MOGHE由Erlangen神经病理学小组于2017年首次描述，并于2022年被纳入国际抗癫痫联盟（ILAE）局灶性皮层发育不良分类。组织病理学上，MOGHE以白质内局灶性少突胶质细胞密度增高和异位神经元为特征，常伴有髓鞘形成不足，对应于少突胶质细胞增生区域。MOGHE患者主要表现为两种临床表型：早发型癫痫性脑病，以癫痫痉挛和显著的认知损害为特征；以及药物难治性局灶性癫痫，通常在青少年或成年早期起病，认知功能正常或临界。磁共振成像（MRI）常显示轻度皮层增厚、灰白质交界处T2/液体衰减反转恢复（FLAIR）信号增高（即“电源按钮征”），以及老年患者皮髓质分界模糊或减退，反映了潜在的白质异常。
对来自多中心儿科队列的切除脑组织进行深度靶向测序，发现约50%的MOGHE个体中存在X连锁SLC35A2基因的致病变体。SLC35A2基因的种系新生杂合及半合子致病变体（后者也处于嵌合状态）与先天性糖基化障碍IIm型相关。该疾病表现为婴儿期起病的癫痫发作、发育迟缓、智力障碍、骨骼畸形和脑畸形。SLC35A2编码一种UDP-半乳糖转运蛋白，负责将半乳糖从细胞质转运至高尔基体腔内。这一过程对蛋白质和脂质的糖基化至关重要。多项研究证实了SLC35A2变体与MOGHE的持续关联，以及其与难治性新皮质癫痫的关联，支持其在疾病发病机制中的作用。近期证据显示，携带SLC35A2无义变体的患者脑白质中SLC35A2蛋白显著减少，表明变体类型可能影响治疗反应。然而，SLC35A2变体的个体间差异可能是既往临床研究中对D-半乳糖补充疗法反应不同的原因，一些患者临床获益，而另一些则无效。尽管有这些发现，约一半的MOGHE个体缺乏可识别的致病变体，其遗传病因仍未得到解释。虽然性染色体非整倍体与神经发育障碍和神经功能损害的关联日益增加，但其在癫痫中的作用尚未被探索。在Turner综合征（45,X）、Klinefelter综合征（47,XXY）、47,XYY综合征（47,XYY）和47,XXX综合征（47,XXX）患者中，癫痫发作均有持续报道。病例报告和小规模系列研究描述了部分47,XYY综合征患者的癫痫或脑电图异常，基于人群的研究提示该组个体神经发病率增加。基于这些已发表的观察，结构异常或Y染色体嵌合可能参与了癫痫发生过程。迄今为止，尚无研究系统地检查MOGHE中的Y染色体嵌合现象。本研究揭示了男性和女性个体中重复出现的Y染色体增益，这些增益局限于病变白质，在邻近的非病变皮质中缺失，提示病变相关嵌合可能是MOGHE的一种新的、额外的致病机制。
2 材料与方法
2.1 队列选择
脑组织样本来自埃尔朗根大学医院癫痫中心、Bethel癫痫中心和Schoen Clinic Vogtareuth（均位于德国）。病例从埃尔朗根大学医院神经病理学研究所的诊断档案中回顾性选择。纳入标准要求组织病理学诊断为MOGHE、有SLC35A2突变状态信息以及使用Conumee图分析的相应DNA甲基化数据。所有病例均由两名委员会认证的神经病理学家（I.B.和R.C.）根据更新的ILAE诊断标准进行审查。组织病理学特征包括皮质下白质少突胶质细胞密度增加（可呈簇状分布）、经Nissl-Luxol快蓝染色证实的局灶性髓鞘丢失，以及白质内异位神经元。该队列包括29例经组织学确认的MOGHE患者（19例男性，10例女性）。从病历中收集了临床数据，包括性别、癫痫起病年龄、MRI表现和手术结局（表1）。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和新鲜冷冻（FF）组织均可用于组织病理学和分子分析。研究获得了弗里德里希-亚历山大大学埃尔朗根-纽伦堡医学院（#193_18B, 18-192_1-Bio）和明斯特大学（2015-088-f-S）的伦理批准，并获得了所有参与者或法定监护人的书面知情同意。
2.2 遗传背景
所有29个病例均已在先前研究中报道，其中20例（68.9%）携带X连锁SLC35A2基因的脑体细胞致病变体。先前的深度靶向测序鉴定了8个错义变体、8个移码变体、3个无义变体和2个框内变体，变异等位基因频率（VAF）从3%到52%不等；一名患者携带两个变体。其余9例个体在SLC35A2或其他癫痫相关基因中未检出致病变体。虽然无法获取匹配的血液样本，但先前的证据支持SLC35A2变体在MOGHE组织中起源于脑体细胞。14例个体使用靶向基因组合进行分析，其余15例使用标准的MoChA（嵌合染色体改变）流程进行外显子组测序。
2.3 神经心理学评估
在Schoen Clinic Vogtareuth，对13名德语使用者中的个体以及在Bethel癫痫中心对所有个体进行了标准化的纵向神经心理学评估。评估在术前和术后6个月及24个月进行，使用适合年龄的工具：汉堡-韦氏儿童智力量表、韦氏成人智力量表、贝利婴幼儿发展量表第二版和Vineland适应行为量表。根据国际疾病分类第十版标准对认知结局进行分类：无损害/平均（智商[IQ] ≥ 85）、临界（IQ = 70–84）、轻度（IQ = 50–69）、中度（IQ = 35–49）或重度/极重度（IQ < 35）。在Bethel中心，使用了类似的工具，包括贝利婴幼儿发展量表第二版、韦氏学前和小学智力量表或韦氏儿童智力量表，以及麦卡锡儿童能力量表。成年患者使用词汇测验和逻辑推理分测验来估计一般智力能力。
2.4 DNA甲基化及拷贝数变异分析
使用Illumina Infinium MethylationEPIC基因芯片（850K）对FF组织进行全基因组DNA甲基化谱分析。原始IDAT文件在R（v4.3）中使用minfi包（v1.46.0）处理，采用Noob标准化并比对到hg19参考基因组。使用优化版的conumee R包（github.com/FAU-DLM/conumee.git）生成拷贝数变异（CNV）图谱，并使用内部参考对照进行标准化。基因注释基于EnsDb.Hsapiens.v86，限于蛋白质编码基因。根据Illumina EPIC注释文件（EPICanno.ilm10b4.hg19）筛选高可信度位点的探针。根据log2比值阈值（男性 > 0.4，女性 > 0.0）定义Y染色体增益。质量控制包括探针覆盖度阈值、排除低可信度区域和匹配对照标准化。为所有样本生成全基因组和染色体特异性CNV图。
为评估Y染色体增益的特异性，纳入了一个包含147个DNA甲基化衍生CNV图谱的独立比较队列，包括33例轻度皮层发育不良（mMCD；16例女性，17例男性）、47例局灶性皮层发育不良II型（FCDII；18例女性，29例男性）和67例低级别癫痫相关肿瘤（LEAT）样本（27例女性，40例男性）。样本来源于癫痫手术病例，先前由Jabari等人报道（表2）。然而，在该先前研究中未进行性染色体特异性CNV分析。
2.5 发色团和荧光原位杂交
使用ZytoDot 2C CEN X/Y探针（ZytoVision）进行发色团原位杂交（CISH），其中X探针靶向Xp11.1–q11.1（红色信号），Y探针靶向Yp11.1-q11.1（绿色信号）。信号检测使用抗DIG/DNP抗体混合物与HRP/AP聚合酶系统和发色团底物。荧光原位杂交（FISH）采用ZytoLight CEN X/Y双色探针，其中ZyGreen标记X着丝粒，ZyOrange标记Y着丝粒。一名男性和一名女性颞叶癫痫病例作为非MOGHE对照。细胞核用苏木精复染，切片使用Hamamatsu S60扫描仪数字化。FISH成像在Olympus BX51荧光显微镜上使用ColorView 2相机进行。
2.6 Y特异性序列的聚合酶链反应扩增
通过聚合酶链反应（PCR）扩增性别决定区域Y（SRY）基因座来验证Y染色体物质的存在。从同一FFPE块中手动显微解剖病变白质和邻近非病变皮质，以进行样本内比较。使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）提取DNA。使用两步PCR以提高低产量样本的灵敏度。引物扩增一个266-bp的SRY片段（正向：5′-GGA AGC AAA CTG CAA TTC TTC GG-3′；反向：5′-GAT AGA GTT GAA GCG ACC CAT GAA-3′）。产物在3%琼脂糖凝胶上使用RedSafe核酸染料在紫外灯下可视化。每次运行包括有和没有MOGHE的男性和女性对照。对7例Y阳性女性病例进行了定性PCR验证。整个过程由一名女性操作员执行，以避免任何可能的Y遗传物质污染，所有运行均进行三次技术重复。
2.7 统计分析
使用GraphPad Prism（v10.1）和R（v4.3）进行统计分析。连续变量以中位数和四分位距（IQR）总结，分类变量以计数和百分比总结。非参数变量（包括癫痫发作年龄和病变大小）的组间比较采用Kruskal-Wallis检验。分类变量之间的关联使用Fisher检验。双侧p值 < 0.05被认为具有统计学显著性。由于样本量有限，临床数据（病变大小、癫痫发作年龄和神经心理学评估）的关联未达到统计学显著性，这些结果更多反映一种趋势。
3 结果
3.1 DNA甲基化衍生的CNV分析揭示Y染色体增益
对29例MOGHE患者（19例男性，10例女性）进行了基于DNA甲基化谱的CNV分析。在19例男性中的16例（84.2%）中检测到显著的Y染色体序列增益，log2比值从+0.4到+1.2，超过了CNV检测阈值（图1A）。出乎意料的是，在10例女性中的5例（50%）中也检测到Y染色体增益，log2比值从+0.0到+1.0（图1B）。在两名女性（ID 9和10）和一名男性（ID 14）中，CNV图谱不确定，并通过FISH和/或PCR得到确认。在常染色体或X染色体上未检测到显著的CNV。所有个体的个体CNV图显示在图S1中。在来自其他癫痫性脑病变的147个DNA甲基化衍生CNV图谱的独立比较队列中（表2），在8例（5.4%）中识别出Y染色体增益，且均出现在男性中。包括1/33 mMCD样本、2/47 FCDII样本和5/67 LEAT样本。使用Fisher精确检验的成对比较显示，与mMCD（比值比[OR] = 13.4，Bonferroni校正p值[adj p值] = 0.007）、FCDII（OR = 9.4，adj p值 = 0.003）和LEAT（OR = 5.2，adj p值 = 0.009）相比，Y染色体增益在MOGHE中显著富集。
基于SLC35A2突变状态和Y染色体CNV的综合分析，将队列分层为三个不同的亚组：第1组，携带致病性SLC35A2变体但未检出Y染色体增益的个体（n = 8）；第2组，携带致病性SLC35A2变体并伴有Y染色体增益的个体（n = 12）；第3组，缺乏SLC35A2突变但表现出Y染色体增益的个体（n = 9；表1）。
3.2 基因定义MOGHE亚组的临床发现
三个分子定义的亚组之间，中位癫痫发作年龄存在差异，尽管这些比较是探索性的，未达到统计学显著性（Kruskal-Wallis检验，H = 2.786，p = 0.25）。具有Y染色体增益的患者倾向于表现出更早的疾病起病（Kruskal-Wallis检验，H = 2.786，p = 0.25）。第1组、第2组和第3组的中位发病年龄分别为3.9岁（IQR = 0.54–13.5，范围 = 0.16–24岁）、0.58岁（IQR = 0.455–1.04，范围 = 0.25–3岁）和2.0岁（IQR = 0.54–5.25，范围 = 0.33–12岁）。
根据术前MRI，各组的病变大小有所不同。第1组通常表现为小的、界限清楚的额叶病变，常位于眶额叶、额中线或眶极（图2A）。第2组表现出更大的病变，其中6/12例为半球性，3例为多脑叶（图2B）。第3组具有中等至大的病变，包括1例半球性病例，大多数累及整个额叶（图2C）。较大的病变往往与更早的癫痫发作年龄相关，尤其是在第2组。
20例患者获得了神经心理学评估结果（表1），分子定义的MOGHE亚组之间未显示统计学显著差异。然而，在第1组中，智力功能范围从重度损害到平均，大多数患者术后保持稳定或略有改善（例如，临界 → 平均）。两名患者术前术后均无损害。第2组表现出更显著的缺陷，主要为中度至重度，其中3例有所改善。第3组表现出异质性结局，从严重残疾到正常认知，大多保持稳定轨迹，偶有改善。总体而言，术后认知保持稳定或适度改善，第1组认知结局最佳，第2组损害最严重，第3组最具变异性。
组织病理学显示各MOGHE亚组之间无显著差异。平均少突胶质细胞密度（OLIG2阳性核/mm2）相似（第1组：2416；第2组：2376；第3组：2153；p > 0.05）。增殖活性普遍较低（所有样本Ki-67 < 1%）。第1组的Nissl-Luxol快蓝染色显示的髓鞘形成不足最不明显，在第2组中有7/12例存在，在第3组中最为常见，这与先前发现一致，即髓鞘形成不足随患者年龄增长而减少。
3.3 原位杂交证实病变组织中的Y染色体增益
使用双色着丝粒X/Y探针（ZytoVision）进行FISH和CISH，以在细胞水平上验证CNV结果。FISH显示Y阳性细胞核主要分布在少突胶质细胞增生区域（图3A），其中X信号为绿色，Y信号为红色。在通过CNV检测到Y增益的女性个体中，包括1例CNV结果不确定的（ID 9），FISH在所有病例中均证实存在Y阳性细胞核，即使在CNV图谱不确定时也验证了Y染色体序列的存在。病变白质内的散在细胞核在原本为XX的细胞中显示出额外的Y信号。女性CNV阴性病例仅显示两个X信号，作为内部对照。具有Y染色体增益的男性个体的细胞核显示一个X和两个Y信号，证实了额外的Y物质。CISH提供了正交验证，支持FISH发现，尽管荧光成像具有更高的分辨率（图3B）。由于FFPE切片中频繁出现细胞核截断，无法进行定量计数，结果仍为定性。重要的是，Y阳性细胞核与病变白质相关，在上方的皮层或CNV阴性对照中缺失，支持其局限在少突胶质细胞增生区域。为了初步评估Y染色体的结构完整性，研究人员使用靶向CENX、CENY和Yq12（DYZ1）的探针，在5名女性和6名男性中进行了额外的FISH分析。在所有女性（n = 5）中，观察到CENY和Yq12信号的共定位，与整条Y染色体的增益一致。同样，在50%的男性（n = 3）中，共定位支持存在一条完整的额外Y染色体。
在其余男性（n = 3）中，检测到Yq12信号扩增以及与CENY的部分空间分离，提示可能存在Y染色体长臂扩增或将Yq12物质整合到其他染色体区域（图2）。然而，在间期FISH分析中，当两个信号的部分空间分离非常微小时，可能反映染色质构型或细胞核结构的变异，而非结构染色体异常。因此，这些观察结果应被视为初步的，需谨慎解释。
3.4 MOGHE女性患者中Y染色体序列的PCR验证
对7例女性个体的病变和非病变DNA进行了SRY基因座的PCR扩增（表1）。该亚组包括4名经CNV确认Y增益的女性、1名CNV结果不确定的女性，以及2名CNV阴性病例（ID 4和5）作为对照。额外的阴性DNA对照来自一名患有神经节胶质瘤的女性，阳性DNA对照来自一名颞叶癫痫男性（图4）。在组织学和OLIG2免疫染色的指导下，对白质和皮质进行手动显微解剖（图4A）。在所有CNV阳性和CNV结果不确定的女性病例中均检测到Y特异性扩增子，即使在CNV数据不明确时也证实了Y序列的存在。在CNV阴性的MOGHE病例或阴性对照中未发生扩增。在病例内，Y特异性扩增子在病变白质中持续被检测到，但在配对的皮质中缺失，支持脑标本内与病变相关的定位，并在外周组织缺失的情况下提供了样本内对照（图4B）。
女性MOGHE病例中SRY特异性扩增子的存在，支持了CNV和原位杂交（ISH）结果，表明存在与病变相关的Y染色体增益嵌合现象。通过ISH或PCR在CNV阴性病例中未检测到Y信号。总之，CNV、FISH/CISH和PCR分析证实了MOGHE男性和女性个体中与病变相关的Y染色体增益，局限于少突胶质细胞增生区域。
4 讨论
在29例经组织病理学确诊的MOGHE患者中，72%的手术切除脑组织中发现了重复出现的、与病变相关的Y染色体序列增益，在84%的男性和50%的女性中检测到。通过三种互补方法，Y染色体增益持续在病变白质中观察到，并富集于少突胶质细胞簇中。与X连锁SLC35A2变体一起，这些发现确定了MOGHE队列中一种共享的基因组特征（单独SLC35A2变体[28%]、单独Y染色体增益[31%]或两者兼有[41%]），但并不意味着其具有明确的致病作用。对包含147例癫痫性脑病变的独立比较队列的分析表明，Y染色体增益在MOGHE中显著富集，但在mMCD、FCDII和LEAT样本中罕见。
MOGHE是一种新近定义的发育性病变，主要与脑体细胞SLC35A2变体相关，该变体约占已报道病例的一半。本研究通过识别Y染色体增益嵌合现象作为额外的、重复出现的基因组观察结果，扩展了这一分子谱系。虽然在血液和大脑中已报道过体细胞Y染色体丢失作为一种年龄相关事件，但在皮质畸形中出现Y物质的局灶性增益尚未被描述，其生物学意义仍不确定。在近半数个体中SLC35A2变体与Y染色体增益的共存，提示存在影响糖基化、少突胶质细胞增殖或皮质环路组织的趋同机制。这些数据也支持更广泛的概念，即性染色体改变（超越经典的非整倍体如47,XXY或Klinefelter综合征）可能参与癫痫发生过程。
尽管所有MOGHE样本均表现出一致的组织病理学特征，但临床定义的亚组在疾病起病和病变范围上显示出不同的倾向。同时携带SLC35A2变体和Y染色体增益的亚组占队列的最大比例（41%），并表现出中位癫痫发作年龄更早、病变更大和认知损害更显著的趋势，但未达到统计学显著性。仅具有Y染色体增益的患者也倾向于比仅携带SLC35A2变体的患者更早起病和病变更大。然而，这些观察描述的是一种趋势，在小样本队列中未达到统计学显著性，需要在独立的大型研究中得到证实。
MOGHE女性中Y染色体物质的存在，引发了关于其生物学起源以及是否反映脑体细胞嵌合或微嵌合的问题。一种可能的解释是早期胚胎性染色体嵌合，随后大多数细胞丢失Y。一种推测的可能性是消逝的男性双胞胎的残留微嵌合，理论上可能导致特定组织中存在持续的Y阳性细胞群；然而，在缺乏关于双胎妊娠的临床信息或外周组织分析的情况下，无法评估这一情景。在性染色体嵌合的背景下，以及在母体脑组织中由于男性微嵌合（可能源于胎儿-母体细胞交换），也描述了Y阳性细胞群。在男性中，Y染色体增益可能是早期神经发育过程中有丝分裂不分离的结果，产生Y阳性少突胶质细胞的嵌合群体。在本研究中观察到Y阳性细胞核局限于病变白质，可能反映了在许可微环境内的克隆扩增或Y阳性细胞的选择性存活，但也不能排除其他解释，包括在异常组织内的附带现象积累。因此，检测到的Y染色体物质的功能后果仍悬而未决，本数据无法证明其对少突胶质细胞生物学或癫痫发生的潜在影响。然而，这些结果扩展了先前将性染色体异常与神经发育障碍和癫痫联系起来的证据，并将嵌合性Y染色体增益确定为病变性癫痫中的一个新特征。
研究结果揭示了MOGHE中的一个新基因组特征，强调了性染色体异常在皮质畸形中的潜在作用，并为未来在更大队列中研究以阐明其临床和致病相关性提供了框架。它们也强调了在药物难治性儿童癫痫的诊断检查中进行分子分析的必要性，对MOGHE分子基础的更好定义，将为未来研究针对SLC35A2相关糖基化缺陷或染色体嵌合相关皮质畸形患者的靶向治疗策略开辟新途径。
4.1 局限性
本研究存在几个局限性。Y阳性细胞核的细胞来源无法确定，因此无法解决这些细胞是代表脑内源性嵌合还是微嵌合浸润的问题。分析仅限于脑组织，无法评估Y阳性细胞的系统分布。这一局限性反映了队列的回顾性性质，其手术时间早于建立外周组织长期储存（例如，粘膜拭子和血液）的常规。适中的队列大小（n = 29）限制了检测显著基因型-表型关联的统计效力，例如与疾病起病、病变大小和认知损害相关的关联。此外，Y染色体增益的功能意义，无论是在病变形成中起因果作用还是次要现象，仍不确定。未来需要采用单细胞基因组学和转录组学分析的研究，以阐明MOGHE中Y染色体嵌合的结构性质、谱系来源和生物学影响。
5 结论
Y染色体增益代表了MOGHE男性和女性患者中一种重复出现的、与病变相关的基因组发现，并且基于现有数据，是一种局限于少突胶质细胞增生区域的脑体细胞事件。这些增益是否促进病变发展还是代表异常组织内的继发性变化，仍悬而未决。与SLC35A2变体一起，这些改变为所有MOGHE个体提供了一种共享的基因组关联。这些发现拓宽了当前对皮质畸形潜在遗传机制的理解，并支持了性染色体生物学在病变性癫痫发病机制中的作用。
