《Pathology》：Development and validation of a real-time PCR for the detection of Haycocknema perplexum
编辑推荐：
Haycocknema perplexum是一种罕见且新出现的寄生性肌炎（parasitic myositis）病因。鉴于有利于传播的气候条件日益增加，检测和监测变得越来越重要。在本研究中，研究人员开发了一种实时聚合酶链反应（PCR）方法，用于直接检测Hayc
Haycocknema perplexum是一种罕见且新出现的寄生性肌炎（parasitic myositis）病因。鉴于有利于传播的气候条件日益增加，检测和监测变得越来越重要。在本研究中，研究人员开发了一种实时聚合酶链反应（PCR）方法，用于直接检测Haycocknema perplexum的两个基因组区域。实时PCR检测，包括SSU-PCR和COX-1-PCR，分别针对核糖体RNA小亚基（small subunit of nuclear ribosomal RNA）和细胞色素氧化酶-1（cytochrome oxidase-1）基因组区域。使用一组H. perplexum样本（包括新鲜冷冻和福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE），共22份，来自8名患者）和非H. perplexum（n=8）组织活检标本评估了检测性能。两种H. perplexum检测对SSU和COX-1靶标的敏感性分别为92%和84%，特异性为100%，阴性预测值和阳性预测值分别为100%和93%。结果表明，COX-1-PCR的检测限为10-5稀释度[循环阈值（Ct）值40.2]，SSU-PCR的检测限为10-3稀释度（Ct值39.6），使得后者对于检测患者活检中较低浓度的生物体更为敏感。新鲜冷冻样本的敏感性优于FFPE样本。除一个样本外，所有治疗后样本均为阴性。实时PCR直接从组织活检中检测H. perplexum的可行性已得到证实，可用于诊断、可能的疗效测试，并可加强传播监测。
Haycocknema perplexum是一种罕见且新出现的寄生性肌炎（parasitic myositis）病原体，首次于1998年在澳大利亚塔斯马尼亚州报告，此后陆续有病例报道，均与居住或旅行至昆士兰州北部或塔斯马尼亚州有关。该病原体的分类学历史复杂，曾被归类于Robertdollfusidae科，但基因组分析将其置于色矛纲（Chromadorea class）。其传播途径尚不明确，可能涉及皮肤接触、摄入或节肢动物媒介宿主，患者常出现进行性肌无力、吞咽困难、体重减轻，实验室检查显示肌酸激酶（CK）升高、外周嗜酸性粒细胞增多和肝功能异常。诊断依赖于肌肉活检中观察到细胞内非包囊线虫（长度约350 μm，宽度约20 μm），但病理学家需要熟悉该生物特征才能准确识别，且分子诊断工具此前有限。随着气候变化可能增加传播风险，开发快速、准确的诊断方法至关重要。因此，本研究旨在开发并验证一种基于实时荧光定量PCR的分子检测方法，用于直接从肌肉活检样本中检测H. perplexum，以作为临床诊断、疗效评估和传播监测的辅助工具。
研究人员开展了针对H. perplexum的两种实时TaqMan PCR检测方法的开发与验证，分别靶向核糖体RNA小亚基（SSU）和细胞色素氧化酶-1（COX-1）基因组区域。研究通过回顾性收集临床样本进行性能评估，样本来源于昆士兰病理学实验室（Pathology Queensland），包括1994年至2022年间收集的新鲜冷冻组织和FFPE组织活检标本，其中H. perplexum阳性样本来自确诊患者（共22份，来自8名患者），阴性样本来自其他肌肉病理或寄生虫感染（如蛲虫Enterobius vermicularis和弓形虫Toxoplasma gondii）的活检（共8份）。该研究于《Pathology》期刊发表，为临床提供了新的分子诊断工具，具有高特异性和敏感性，可改善H. perplexum感染的早期检测和管理。
本研究使用的关键技术方法包括：实时荧光定量PCR（qPCR），采用TaqMan探针和引物靶向H. perplexum的SSU和COX-1区域；DNA提取使用Roche MagNA Pure 96系统；PCR设置和扩增分别使用QIAgility和Rotor-Gene Q仪器；评估性能时，使用十倍稀释系列进行半定量检测限（LOD）分析，并与组织病理学（金标准）比较；此外，通过与马疱疹病毒提取内控（EHV-EC）双重PCR进行比较验证，以确保检测可靠性。样本队列来源于昆士兰病理学实验室的临床存档组织，包括新鲜冷冻和FFPE样本。
研究结果以多个小标题呈现，主要包括性能评估、检测限分析和临床应用验证。在性能评估方面，研究人员对22份H. perplexum阳性样本和8份非H. perplexum样本进行了检测，结果显示两种PCR靶标（SSU和COX-1）的特异性均为100%，无交叉反应性；敏感性方面，新鲜冷冻样本的敏感性为100%，FFPE样本中COX-1靶标为75%、SSU靶标为88%，整体敏感性分别为84%（COX-1）和92%（SSU），表明SSU-PCR对低浓度生物体更敏感。在检测限分析方面，通过十倍稀释新鲜冷冻组织DNA提取物，COX-1-PCR的检测限为10
-4稀释度（Ct值38.15-40.27），SSU-PCR为10
-3稀释度（Ct值39.08-39.31），提示SSU靶标在低载量样本中检测能力更强。在临床应用验证方面，治疗后样本（除一例外）均未检测到H. perplexum DNA，与组织病理学结果一致，支持该方法在诊断和疗效测试中的实用性；此外，双重PCR与EHV内控的结合未干扰检测，证实了方法的稳健性。
讨论部分总结指出，本研究开发的实时PCR检测方法在H. perplexum诊断中具有显著效用，新鲜冷冻样本的敏感性优于FFPE样本，提示临床疑似病例应优先收集新鲜组织。该检测方法的特异性高，无交叉反应性，且已通过双重PCR与内控结合验证，可在昆士兰病理学实验室常规应用。大多数病例报告与澳大利亚塔斯马尼亚州或昆士兰州北部相关，临床表现为肌无力、体重减轻和吞咽困难，实验室检查常见CK升高和嗜酸性粒细胞增多，治疗以阿苯达唑为主，但皮质类固醇可能加重病情。从诊断角度，组织病理学特征是关键，但分子检测可作为辅助工具，尤其在资源有限或病理结果不明确时。研究局限性包括未测试对其他组织寄生线虫（如旋毛虫Trichinella或粪类圆线虫Strongyloides）的特异性，未来工作需进一步验证。该检测方法的实施可促进早期诊断、改善临床结局，并有助于流行病学调查。
研究结论部分指出：研究人员正在努力对H. perplexum基因组进行测序，未来需阐明其分类学、生物学特性，提高临床认知并优化治疗方案；此外，最佳活检解剖部位尚不确定，随着对该生物了解的增加，可能开发更微创的诊断选项；针对H. perplexum的特异性检测方法为调查潜在的人畜共患宿主和环境感染源提供了关键流行病学工具。
