一种基于三维DNA行走器（3D-DNA-walker）和杂交链反应（hybridization chain reaction）的三信号放大比色生物传感器，用于灵敏检测四环素残留物

《Talanta》：A triple-signal-amplified colorimetric biosensor based on 3D-DNA-walker and hybridization chain reaction for sensitive detection of tetracycline residues

　　

杨思|李晨曦|刘荣|陈文亮|陈伟|徐可欣

天津科技大学电子信息与自动化学院，天津，300457，中国

摘要

食品中的四环素残留物仍然对食品安全构成威胁，因此对四环素的灵敏检测对于残留物监测非常重要。在此，我们开发了一种三重扩增比色生物传感器，用于检测母体四环素（TET），该传感器结合了基于适配体的识别技术、三维DNA行走器、杂交链反应（HCR）和G-四链体DNA酶催化作用。当目标分子结合时，适配体会释放多个互补的DNA链，从而引发链位移并激活DNA行走器以持续产生信号。生成的DNA链随后触发HCR反应，形成富含G-四链体的纳米结构。在加入血红素后，这些DNA酶会催化2,2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）被H₂O₂氧化，产生明显的颜色变化，便于视觉观察和基于吸光的定量分析。在优化条件下，该生物传感器对TET浓度的响应呈线性，范围为0.005至10?ng/mL，检测限为0.00326?ng/mL。在添加了四环素的原始牛奶样品中，回收率为98.8-104.0%，相对标准偏差（RSD）为0.1-1.5%。这种设计的三重扩增比色生物传感器为检测添加了四环素的原始牛奶样品提供了灵敏的方法。

引言

四环素（TET）是一种广谱抗生素，由于其低成本和有效的抗菌特性，在临床治疗和畜牧业中得到广泛应用[[1], [2], [3]]。然而，其广泛使用导致食品和环境中的残留物持续存在，引发了人们对抗生素耐药性和通过食物链对人类健康潜在风险的严重担忧[4,5]。传统的检测方法，包括高效液相色谱（HPLC）[6,7]、毛细管电泳（CE）[8,9]和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[10,11]，具有高灵敏度、准确性和强大的多残留物分析能力。然而，这些方法依赖于复杂的仪器、相对复杂的样品处理程序以及需要受过培训的操作人员，这限制了它们在仪器资源有限的分析环境中的广泛应用。因此，结合特定分子识别和灵敏信号转导的生物传感方法因操作简便和对大型仪器的依赖性较低而受到越来越多的关注。

在这种情况下，基于适配体的生物传感策略提供了一种可编程的分子识别途径，用于构建灵敏的检测系统。适配体是单链DNA或RNA寡核苷酸，通常通过指数富集（SELEX）系统地进化 ligands 而生成，它们可以折叠成特定的三维结构，以高亲和力和特异性结合目标分子。当目标分子结合时，适配体可能会发生结构重排或诱导预先设计的寡核苷酸片段的释放，这些片段可以与下游的信号转导和扩增模块耦合[[12], [13], [14]]。与基于抗体的识别元件相比，适配体具有化学合成容易、易于修饰、储存稳定性高、批次间变异小以及序列可编程等优点，使其非常适合集成到基于DNA的反应网络中。当与多个互补链耦合时，适配体的构象转换可以同时释放多个寡核苷酸片段，建立“一对一多”的释放机制，从而增强初始信号输出[15]。这种策略将单一的识别事件转化为多个下游触发事件，从而增加后续扩增反应可用的信号输入。然而，对于痕量分析物，来自初始适配体识别事件的信号仍然有限，仍需要有效的扩增策略来实现灵敏的四环素检测。

目标分子诱导的适配体构象变化可以暴露或释放特定的DNA片段，这些片段可作为各种等温扩增技术的触发剂，例如链位移扩增（SDA）[16]、杂交链反应（HCR）[17,18]、催化发夹组装（CHA）[19,20]和滚环扩增（RCA）[21,22]。例如，崔等人开发了一种适配体传感器，利用目标诱导的CHA来检测牛奶中的卡那霉素。结合后，适配体触发自主的CHA扩增，检测限达到0.26?ng/mL，这突显了适配体直接启动核酸网络以实现稳定且成本效益高的信号增强的潜力[23]。这些方法通过生成大量的核酸产物有效放大了检测信号。然而，它们依赖于扩散受限的均相反应，这往往会影响反应动力学和信号效率。

近年来，受天然分子机器启发的人工DNA行走器作为动态纳米设备的一类，在生物传感应用中崭露头角[24,25]。这些结构利用了DNA自组装的内在可编程性，使寡核苷酸序列能够沿着预先设计的轨道逐步迁移[26]。DNA行走器的独特机械移动允许在特定触发下进行连续和重复的操作，从而通过迭代循环实现累积信号生成[27,28]。特别是三维DNA行走器（3D-DNA-walker），由于其增大的反应界面和增强的核酸富集能力[29]，已被用于构建能够检测多种目标物的多功能生物传感器，包括小分子[30,31]、离子[32]、核酸[33]、蛋白质[34]甚至活细胞[35]。然而，许多现有行走器的运动依赖于核酸酶介导的切割或不可逆的链消耗，导致轨道逐渐失活，限制了长期信号放大。为了解决这些挑战，通常与传统的等温核酸扩增技术结合的级联信号放大策略已被广泛采用，并被认为是提高基于DNA行走器的生物传感系统灵敏度的有效方法。李等人开发了一种与金纳米粒子上的CHA结合的3D-DNA-walker，实现了病原体检测的信号放大[36]。宋等人将DNA行走器介导的CRISPR/Cas12a激活与HCR结合，构建了一个高能量自供电的生物传感平台，通过多层信号放大和自主信号转导实现了超灵敏的microRNA检测[37]。尽管取得了这些进展，但在保持检测简单性、稳定性和可靠信号转导的同时，将多种扩增策略集成到单一平台中仍然是一个关键挑战。

在这项工作中，我们提出了一种合理设计的三重信号放大比色生物传感器，用于灵敏检测TET。尽管已有几种针对四环素抗生素的适配体被报道[12]，但本研究选择了Apt76[38]，因为其相对较长的序列提供了足够的可编程区域，用于构建目标触发多cDNA释放系统。这一特性对于第一阶段的扩增策略至关重要，在该阶段，一次TET结合事件会诱导Apt76的构象重排并释放多个预杂交的互补DNA链（cDNA），从而将单一的分子识别事件转化为多个下游激活剂。这些释放的cDNA随后在3D-DNA行走器系统中与Lock DNA引发链位移反应，激活行走探针的DNA酶结构域。与蛋白质酶驱动的行走器相比，我们的方法使用了一种依赖金属离子的8-17 DNA酶[39]，提供了一种稳健、低成本且可编程的替代方案，确保了稳定的逐步运动和持续的信号放大。激活的行走器随后催化切割含有核苷酸（rA）位点的发夹DNA（H1），并在三维轨道上连续生成信号链（S1），构成第二步扩增。S1链进一步触发H2和H3发夹DNA之间的HCR反应，形成富含G-四链体的结构。在血红素存在下，形成具有过氧化物酶活性的G-四链体DNA酶，并催化ABTS^2?被H₂O₂氧化，产生从浅绿色到深绿色的颜色变化，完成第三步扩增。这种三级扩增策略具有多个优势：（1）适配体介导的“一对一多”释放增强了初始信号水平；（2）DNA酶辅助的3D-DNA行走器确保了连续的信号积累和稳定性的提高；（3）HCR触发的G-四链体/DNA酶形成实现了基于颜色的可视化和基于吸光的定量分析。总体而言，这种策略提供了一种级联放大的比色生物传感方法，用于灵敏检测母体TET。

章节片段

化学物质和材料

本研究中使用的所有寡核苷酸序列均由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）化学合成并通过HPLC纯化。详细序列列于表1中。本研究中使用的适配体称为Apt76，由Niazi、Lee和Gu使用改进的Toggle-SELEX策略结合Flu-Mag SELEX技术筛选得到[38]。这种76个核苷酸的ssDNA适配体据报道能与TET结合，解离常数为63.6?nM。

三重信号放大比色生物传感器的原理

开发了一种三重信号放大比色生物传感器，用于灵敏检测TET，并伴有视觉颜色变化，基于级联放大策略，包括目标诱导的构象转换（图1A）、三维DNA行走器（3D-DNA-walker）介导的信号增强（图1B）和杂交链反应（HCR）（图1C）。具体而言，生物素化的Apt76适配体被固定在链霉亲和素包被的MBs上，并与多个互补

结论

在这项工作中，我们开发了一种三重信号放大的比色生物传感器，结合了目标触发的“一对一多”互补链释放策略、基于3D-DNA行走器的酶促扩增和HCR，用于灵敏检测母体TET。该级联系统将基于适配体的分子识别转化为视觉颜色变化和基于吸光的定量分析。在优化条件下，该生物传感器的检测限为0.00326?ng/mL，响应呈线性

CRediT作者贡献声明

杨思：数据整理、软件开发、初稿撰写。李晨曦：资金获取、撰写及审稿编辑。刘荣：数据分析、资金获取、验证。陈文亮：数据分析、验证。陈伟：资金获取、撰写及审稿编辑。徐可欣：数据分析、验证。

利益冲突声明

我们声明与提交的工作无关的任何商业或关联利益冲突。

致谢

作者感谢中国国家重点研发计划（编号2023YFD1701801和2023YFD1701802）；国家自然科学基金（编号82001916、81971657和81871396）；天津市重点医学学科（专业）建设项目（编号TJYXZDXK-016?A）和天津市重大科技项目（编号24ZXZSSS00010）提供的财政支持。