经过优化的鞭毛蛋白能够增强由SARS-CoV-2病毒样颗粒疫苗诱导的全身性和黏膜免疫反应

《Vaccine》：Optimized flagellin enhances systemic and mucosal immune responses induced by SARS-CoV-2 virus-like particle vaccines

　　

李松|何国宇|崔耀丹|谭瑞萌|王月|张慧|钱文|耿世忠|潘志明|焦新安

江苏省人畜共患病重点实验室/江苏省重要动物传染病与人畜共患病防控协同创新中心，扬州大学，中国扬州225009

摘要

背景

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）持续变异，目前的注射疫苗仅能诱导有限的黏膜免疫反应，而临床用的亚单位黏膜疫苗和安全的佐剂仍存在不足。类病毒颗粒（VLPs）是很有前景的疫苗候选物，鞭毛蛋白是一种潜在的TLR5激动剂佐剂，但其较高的内在抗原性仍是一个挑战。

方法

通过杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达SARS-CoV-2的S、E、M蛋白，以制备自组装的VLPs。全长沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC）及其截短变体NCFliC（ΔD2/D3）也被表达并纯化。在HEK293-mTLR5细胞中验证了FliC/NCFliC的TLR5配体活性。BALB/c小鼠通过鼻内接种VLPs单独或与FliC/NCFliC联合接种。通过ELISA、脾细胞增殖试验和细胞因子检测评估了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫反应。

结果

制备的VLPs（约80纳米）保持了天然结构并具有特定的ACE2结合活性。FliC和NCFliC均保留了强烈的TLR5配体活性，能够激活NF-κB并促进IL-8的分泌。鼻内免疫显示NCFliC和FliC均显著增强了VLP特异性的体液免疫（IgG）、Th1型免疫反应（IgG2a/IFN-γ）、黏膜IgA（鼻/支气管肺泡灌洗液）和脾细胞增殖，两者在佐剂效果上没有显著差异。值得注意的是，与FliC相比，NCFliC诱导的FliC特异性血清IgG、IgG亚类（IgG1、IgG2a）以及鼻和支气管肺泡灌洗液中的IgA水平显著较低。

结论

NCFliC在保持强大佐剂活性的同时降低了内在免疫原性，鼻内接种VLP + NCFliC可在小鼠体内引发强烈的全身性和黏膜免疫。NCFliC是一种有前景的SARS-CoV-2 VLP疫苗佐剂，为开发下一代抗冠状病毒黏膜疫苗提供了潜在策略。

引言

2019冠状病毒病（COVID-19）由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起，该病毒持续变异并在全球范围内传播。虽然注射型COVID-19疫苗已被证明能有效降低感染率和死亡率，但它们仅能诱导有限的黏膜免疫，而黏膜免疫对于阻止SARS-CoV-2的感染和传播至关重要[1]。目前批准的大多数COVID-19黏膜疫苗基于病毒载体，缺乏可用于临床的亚单位黏膜疫苗和安全的有效黏膜佐剂[2]。因此，迫切需要开发能够同时诱导强烈全身性和黏膜免疫的下一代疫苗。

VLPs是疫苗设计的很有前景的候选物。作为一种特定类型的亚单位疫苗，VLPs可以触发相对强烈的免疫反应，并提供可靠的安全性。VLPs的形态结构与病原体相关分子模式（PAMPs）相似，能够被免疫系统有效识别[3]。值得注意的是，VLPs的小尺寸使其能够快速通过淋巴结，从而促进B细胞和T细胞的激活[4]。几种基于VLP的疫苗，包括针对人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）的疫苗，已经上市[5]、[6]。SARS-CoV-2 VLPs通常通过在宿主表达系统中共表达刺突（S）、包膜（E）和膜（M）蛋白来生产[7]。目前有7种SARS-CoV-2 VLP疫苗处于临床阶段，另有19种处于临床前开发阶段[8]。大多数研究集中在VLP的组装效率上，而关于添加佐剂的VLP疫苗对抗SARS-CoV-2的有效性的研究较少[9]。尽管取得了这些进展，但很少有基于VLP的COVID-19疫苗获得紧急使用批准，进一步的研究对于提高疫苗效果至关重要。

佐剂不仅在引发强烈的体液免疫反应方面起着关键作用，还在促进有效的黏膜免疫反应方面发挥着重要作用。鞭毛蛋白是细菌鞭毛的结构蛋白，可作为有效的Toll样受体5（TLR5）激动剂[10]。其佐剂特性已在多种动物模型中得到广泛研究，这些模型使用的抗原来自细菌、病毒、真菌和寄生虫；它显示出强大的佐剂效果[11]。虽然基于鞭毛蛋白的疫苗的临床试验正在进行中[12]、[13]，但这类疫苗尚未获得临床使用批准。大量研究探索了减少鞭毛蛋白抗原性的方法[14]，但这一挑战仍未解决。我们之前的研究表明，将H7N9流感病毒的HA1–2与沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC）变体（删除了高度可变的D2和D3结构域）融合后，与HA1–2-FliC融合蛋白相比，系统炎症反应显著降低，鞭毛蛋白特异性抗体也显著减少[15]。

在本研究中，使用杆状病毒表达载体系统在Sf9昆虫细胞中表达了E、M和S蛋白。这些蛋白最终自组装成VLPs。我们使用沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC）及其截短变体（缺少高度可变的D2和D3结构域的NCFliC）作为SARS-CoV-2 VLP疫苗的黏膜佐剂。评估了这些VLP疫苗的免疫原性，旨在为研究和开发安全有效的COVID-19黏膜疫苗提供理论基础。

章节片段

小鼠和伦理声明

特定的无特定病原体的BALB/c雌性小鼠，年龄为6-8周，来自北京Vital River实验室动物技术公司（中国北京）。所有动物都饲养在经过批准的设施中，光照/黑暗周期受控，并在实验期间可以自由获取食物和水。所有小鼠实验程序均获得了扬州大学动物实验伦理委员会的批准[批准编号：SYXK (Su) 2022–0044]，并按照相关规定进行

重组杆状病毒的生成和细胞蛋白表达

为了在昆虫细胞中表达SARS-CoV-2的E、M和S蛋白，构建了两个表达载体（pFastBac1-S和pFastBacDual-ME）（图1A）。质粒被转化到DH10大肠杆菌感受态细胞中，生成bacmid-S和bacmid-ME。将bacmids转染到Sf9细胞中并扩增后，获得了重组杆状病毒P3株。Sf9细胞被重组P3S和P3-ME杆状病毒感染。感染96小时后，收集细胞

讨论

杆状病毒-昆虫细胞系统已被广泛用于生产各种VLPs。在本研究中，生成了两个杆状病毒载体来表达S、E和M蛋白。Sf9细胞被这些rBVs感染，成功表达了S、E和M蛋白。通过TEM分析对细胞裂解液上清液进行共感染和后续分析，发现直径约为80纳米的球形颗粒，其表面具有类似冠状的特征

结论

我们通过杆状病毒介导的表达，在Sf9细胞中成功制备了具有天然结构和ACE2结合活性的SARS-CoV-2病毒样颗粒。纯化的鞭毛蛋白FliC及其截短突变体NCFliC均保留了强烈的TLR5配体活性。体内实验表明，NCFliC作为VLP疫苗的佐剂效果显著：鼻内免疫显著增强了VLP特异性的体液免疫，增强了Th1型免疫反应，并提升了黏膜IgA反应和细胞免疫

CRediT作者贡献声明

李松：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，研究，资金获取，正式分析，概念化。何国宇：可视化，方法学，研究，正式分析。崔耀丹：验证，方法学，研究。谭瑞萌：研究，正式分析。王月：方法学。张慧：方法学。钱文：方法学。耿世忠：方法学。潘志明：撰写 – 审稿与编辑，监督

资助

本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFC2604200）、国家自然科学基金（32102679）、江苏省重点研发计划（现代农业）项目（BE2021331）、江苏省研究生研究与实践创新计划（SJCX24_2322）、

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。