**集成诊断方案用于检测猪SMEDI相关繁殖障碍中的钩端螺旋体属**

《Veterinary and Animal Science》：Integrated diagnostic approach for Leptospira spp. detection in SMEDI associated reproductive disease of swine

本研究在野外条件下，对疑似钩端螺旋体感染引起的猪死产、木乃伊胎、胚胎死亡和不育（SMEDI）相关病例，应用了集成诊断方案进行研究，并旨在评估受影响胎儿中分子检测钩端螺旋体属（*Leptospira* spp.）的最佳样本。因此，研究人员使用了显微镜凝集试验（MAT）检测胎儿和母猪血清抗体，并使用针对*LipL32*基因和16S RNA基因的实时荧光定量PCR（qPCR）检测胎儿样本（肾脏、肝脏、胃内容物、胎粪），分别用于诊断钩端螺旋体属以检测致病性血清型，并区分致病群I和II。本研究共纳入来自16个农场的36窝、142个胎儿。总共有44.4%的母猪血清MAT检测为阳性。在16份血清样本中，有6份（37.5%）仅对一种血清型呈阳性，而10份（62.5%）显示多重阳性结果。母猪对血清型布拉迪斯拉发、波摩那、澳大利亚和秋季热的MAT阳性与相应后代的qPCR阳性结果显著相关。所有PCR阳性样本（n = 20）通过16S RNA基因PCR鉴定，其钩端螺旋体属于亚支系P1或致病群I。肾脏样本的检出率和DNA载量最高，而胃内容物和胎粪样本的检出率和DNA载量最低。

钩端螺旋体病（Leptospirosis）是世界上分布最广的人畜共患病之一，在德国是人类和所有哺乳动物的法定报告疾病。猪对多种致病性钩端螺旋体血清型易感。然而，猪被认为是波摩那（Pomona）和澳大利亚（Australis）血清群的维持宿主，而黄疸出血性（Icterohaemorrhagiae）、流感伤寒（Grippotyphosa）和塔拉索维（Tarassovi）血清群则更常与猪的偶发感染相关。根据德国钩端螺旋体病咨询实验室的被动监测结果，2011年至2016年间，送检用于诊断（监测或病例相关提交）的猪场和单份血清在显微镜凝集试验（Microscopic Agglutination Test, MAT）中的阳性率分别为59.3% - 78.2%和16.3% - 30.9%。近期公布的数据显示，全球猪钩端螺旋体属血清流行率估计为21.9%，欧洲为13.3%。然而，计算出的血清流行率在南美洲（36.4%）、北美洲（34.0%）、非洲（22.1%）或大洋洲（17.4%）更高。就单份血清而言，德国数据显示血清流行率为20.2%，其中血清型布拉迪斯拉发（11.6%）是德国猪群中最流行的，其次是澳大利亚（7.3%）、黄疸出血性（4.0%）、哥本哈根（4.0%）、秋季热（3.7%）、犬型（2.0%）和波摩那（1.2%）。法国最近的数据报告猪的钩端螺旋体血清流行率为22.7%，其中澳大利亚（48.5%）和黄疸出血性（38.2%）被认为是最流行的。此外，还检测到秋季热（6.1%）、巴拿马（5.0%）、巴尔通（1.2%）、塔拉索维（0.5%）、塞罗（0.2%）、流感伤寒（0.2%）、巴达维亚（0.1%）和波摩那（
钩端螺旋体感染在猪场中经常发生，但地方性感染状态不一定导致临床爆发。然而，猪群的初次感染或群体免疫力下降可能导致临床明显的感染。由于钩端螺旋体可在肾脏中持续存在并通过尿液排出，亚临床感染的带菌猪是细菌进一步传播的重要储存宿主。在临床爆发病例中，生殖障碍包括不育、胎儿木乃伊化、流产、死产或弱产胎儿或仔猪是值得注意的变化。SMEDI也被提及为猪钩端螺旋体感染的结果。SMEDI窝的出现取决于胎儿的感染时间。这些窝的典型表现（窝产仔数减少、同一窝内大小递增的木乃伊化、浸溶或死产胎儿）可由最初的母猪病毒血症相关感染胎儿，随后病原体在子宫内水平传播来解释。钩端螺旋体的水平传播也在使用波摩那和塞罗血清型对母猪进行的受控感染研究结果中被假定。此外，浸溶作为细菌分解的迹象，是典型的发现。就生殖临床体征而言，受影响母猪的血清MAT检测或死产胎儿的组织样本PCR检查是实验室进行病因诊断的常规检查。MAT被认为是用于个体动物或流行率研究的钩端螺旋体诊断的标准血清学检测，但疫苗的使用以及钩端螺旋体在家猪群体中的广泛分布和亚临床感染过程，加剧了结果解释的困难。此外，尽管MAT灵敏度良好，但血清型和血清群之间会出现血清学交叉反应，一个受感染的动物很可能对其他血清型产生抗体，通常在较低水平。从组织中分离钩端螺旋体似乎是确诊方法。然而，这种方法的可用性受限，因为培养钩端螺旋体存在困难，以及较长的诊断时间，特别是在野外条件下，这些都构成了主要限制。从这个角度来看，PCR似乎是一种有前景的解决这些缺点的方法。目前已经出现了能够检测致病性血清型的PCR方法，基于*LipL32*基因检测，甚至可以基于钩端螺旋体属的16S RNA基因区分致病群I和II，最近被Vincent等人重新分类为P1和P2。

对于流产或死产病例，仔细的样本提交可能包括受影响胎儿的肺、肝和肾，此外，胃内容物被建议作为疑似细菌性流产（如布鲁氏菌病）的合适样本。由于胎粪包含消化的羊水，它可能是一种易于获取的诊断样本。关于钩端螺旋体属的诊断，建议使用胎儿肾和母畜血清的PCR、免疫组织化学（IHC）和荧光抗体试验（FAT）作为诊断方法。此外，检测死产胎儿中针对钩端螺旋体属的抗体，如果是在妊娠70天后感染，也是一种诊断可能性。胎儿血清中抗体的检测被认为是钩端螺旋体流产的诊断依据。并非所有提及的样本在野外条件下总是可用于进一步的诊断检查或在SMEDI病例中进行检测。因此，在这种病例中，钩端螺旋体属感染的病因诊断仍然是一个挑战。本研究的目的是在野外条件下对这类病例应用集成诊断方案，并评估受影响胎儿中分子检测钩端螺旋体属的最佳样本。因此，研究人员纳入了推荐用于钩端螺旋体诊断的既定样本，并添加了易于获取的材料（胎粪），旨在使兽医能够优化此类病例的钩端螺旋体诊断。检查包括使用MAT对母猪血清、胎儿心血进行血清学检查，以及使用PCR对相应的死产胎儿的组织池、胃内容物和胎粪进行分子生物学检查。

**主要关键技术方法**
本研究的数据来源于2021年7月至2022年2月间收集的诊断转送样本的SMEDI数据库。关键的实验室技术包括：对母猪血清和胎儿心血（针对日龄≥70天的胎儿）进行显微镜凝集试验（MAT），以检测针对11种钩端螺旋体血清型的抗体；以及采用基于*LipL32*基因和16S RNA基因的多重实时荧光定量PCR（qPCR）方法，对每窝随机选取的胎儿（每窝4只，共142个胎儿）的肾脏、肝脏、胃内容物和胎粪的组织池进行钩端螺旋体属DNA检测和致病群分型。统计分析采用了卡方检验、广义估计方程（GEE）等方法。

**研究结果**
**MAT结果**：研究中62.5%（10/16）的SMEDI受影响农场和44.4%（16/36）的单个母猪血清MAT检测为阳性。在16份阳性血清中，37.5%为单一血清型阳性，62.5%为多重血清型阳性。在考虑了*LipL32* PCR阳性或阴性窝次后，发现对应母猪血清中针对血清型布拉迪斯拉发、波摩那和秋季热的抗体检测率显著更高。值得注意的是，针对波摩那血清型的MAT阳性结果仅在*LipL32* PCR阳性窝次对应的母猪血清中显著富集。此外，来自胎儿的23份心血样本（约日龄>70天）的MAT检测均为阴性。

**胎儿检测**：通过*LipL32* qPCR筛查，在单个胎儿的组织池中，总共检测到14.1%（20/142）的胎儿、16.6%（6/36）的窝次和12.5%（2/16）的农场呈阳性。所有阳性样本通过16S RNA基因PCR鉴定均属于亚支系P1或致病群I。广义估计方程（GEE）模型分析显示，浸溶胎儿的组织池检出钩端螺旋体DNA的几率显著高于其他表型（p < 0.001，OR=4.81）。胎儿的冠臀长与DNA检出率或Ct值之间未发现显著关联。

**样本比较**：对PCR阳性池的各样本进行单独检测后，肾脏样本的检出率最高，其次是肝脏、胃内容物，胎粪的检出率最低。进一步的Ct值比较显示，肾脏样本的Ct值显著低于胃内容物（对于16S RNA基因PCR和*LipL32* PCR），表明其DNA载量最高。整体上，16S RNA基因PCR的Ct值低于*LipL32* PCR。

**讨论部分总结**
研究人员指出，本研究聚焦于通过间接（MAT）和直接（PCR）方法检测与母猪及相应胎儿SMEDI相关的钩端螺旋体感染。尽管样本量有限，结果仍表明在诊断此类病例时应考虑钩端螺旋体属。研究发现的母猪MAT阳性率高于一般被动监测数据，这可能与本研究的样本来自明确的SMEDI临床病例有关。血清型波摩那和秋季热仅在与PCR阳性窝次相关的母猪血清中检测到高抗体滴度，提示这些血清群在本次研究的SMEDI病例中可能扮演了相关角色。在胎儿方面，由于溶血和质量问题，冷冻胎儿的心血不适用于检测胎儿抗体。PCR结果显示，浸溶胎儿最易检出钩端螺旋体DNA，这可能与细菌感染导致的胎儿分解有关。虽然*LipL32*基因PCR在数值上比16S RNA基因PCR更灵敏，更适合常规筛查，但两种PCR均显示肾脏和肝脏样本是最佳检测样本，这与钩端螺旋体在感染后主要定殖于肾脏的致病机制相符。胃内容物虽然也有用，但需要破坏胎儿尸体；胎粪作为一种无创获取的替代样本，其较低的敏感性可能需要通过扩大样本量来补偿。

**研究结论翻译**
在研究人群中，仅在有限数量的SMEDI受影响窝次中检测到钩端螺旋体属DNA，并且仅在与PCR阳性窝次相关的母猪中观察到针对血清型波摩那和秋季热的MAT滴度。在所检测的组织中，肾脏样本的PCR阳性率最高且Ct值最低，表明其可能是最适合用于诊断筛查的样本。虽然胎粪提供了一种可通过直肠拭子收集的无创替代方案，但仍需更大规模的研究来进一步评估其诊断效用。综上所述，这些发现表明，结合PCR（优先使用胎儿肾组织）与对相应母猪进行血清学检测（MAT）的集成诊断策略，是检测与SMEDI相关繁殖障碍中钩端螺旋体属的最有效且实用的方法。