淋巴结靶向递送DNA佐剂通过激活TBK1/IFN-I驱动的固有免疫诱导小鼠与非人灵长类动物（NHPs）中的强效T细胞反应和持久免疫记忆

《SCIENCE ADVANCES》：Lymph node–targeted DNA engages TBK1/IFN-I–driven innate immunity to induce potent T cell responses and durable memory in mice and NHPs

佐剂是能够塑造亚单位疫苗诱导的抗原特异性免疫应答强度和质量的免疫激活剂。目前，迫切需要能够安全诱导持久且平衡的体液和细胞免疫应答的有效佐剂。本研究中，研究人员设计了一类两亲性（Amphiphile， AMP）修饰的免疫刺激性DNA佐剂，旨在靶向递送至淋巴结，并增强TANK结合激酶1（TBK1）介导的危险感知通路，从而产生强效的适应性免疫和具有强召回潜力的长期记忆。AMP-DNA佐剂在小鼠和非人灵长类动物（nonhuman primate， NHP）的淋巴结中诱导了强大的I型干扰素（interferon type-I， IFN-I）驱动的炎症环境，导致多种组织中多功能性CD8⁺和CD4⁺ T细胞的细胞因子分泌显著增强，以及T辅助细胞1（TH1）相关和中和抗体应答强烈升高，且未引起全身毒性。这些结果表明，AMP修饰使淋巴结靶向DNA佐剂能够强效激活IFN-I信号通路，从而产生对疫苗效力至关重要的显著的细胞和体液免疫应答。

疫苗自诞生以来就改变了公共卫生成为现状，并且仍然是最具成本效益和最广泛应用的健康干预措施之一。目前，现代蛋白质亚单位疫苗使用高度定义的抗原，以引发针对特定靶标的精确且安全的免疫反应。然而，这些精细的抗原单独使用时，通常缺乏能够激活固有免疫系统以诱导强大且持久免疫的辅助免疫刺激成分。因此，除少数例外（1， 2）外，佐剂已成为刺激靶抗原产生足够反应所必需的亚单位疫苗的不可或缺的组成部分（3）。虽然一些佐剂可以作为抗原递送或储存系统发挥作用，但其他佐剂主要作为免疫刺激剂，通过Toll样受体（Toll-like receptors， TLRs）或其他模式识别受体（pattern recognition receptors， PRRs）激活抗原呈递细胞（antigen-presenting cells， APCs）（4）。迄今为止，市售预防性疫苗中最常用的佐剂是磷酸铝盐佐剂（alum）和油包水乳剂MF59（5）。这些经典佐剂的显著缺点通常包括缺乏长期保护性免疫（4， 6）以及诱导细胞免疫应答的能力差（7），而细胞免疫对于抵御细胞内病原体（如疟疾（8， 9）、结核病（10， 11）和病毒以及癌症（12））至关重要。相比之下，许多分子佐剂，包括TLR激动剂，是有希望的佐剂候选物，因为它们通常刺激I型干扰素（IFN-I）和炎症细胞因子应答，具有诱导强大细胞免疫的潜力（4）。然而，只有少数这些免疫刺激性PRR激动剂已经在临床试验中进行测试并获准用于人类，包括合成双链RNA（例如，聚肌胞苷酸[polycytidylic acid， poly(I:C)]/poly-ICLC，一种TLR3激动剂）、寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotides， ODNs；例如，CpG-7909，一种TLR9激动剂）、环二核苷酸（cyclic dinucleotides）[例如，环鸟苷酸-腺苷酸（cyclic guanosine monophosphate and adenosine monophosphate， cGAMP），一种干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes， STING）激动剂]以及核苷类似物（例如，瑞喹莫德（resiquimod），一种TLR7/8激动剂），其中只有CpG ODNs已在美国获准商业使用。分子佐剂的一个共同障碍是它们倾向于停留在注射部位（分子量>100 kDa）或全身性分布（<20 kDa），因为低分子量化合物很容易通过毛细血管内皮紧密连接扩散到血液循环中（13）。这通常导致快速全身扩散到潜在的免疫学无关或耐受部位。因此，佐剂的全身暴露使得在避免反应原性的同时实现足够的免疫刺激变得困难，需要剂量限制，这限制了它们在实践中的应用（14–16）。然而，佐剂设计和使用递送平台（包括基于皂苷的制剂AS01和Matrix-M以及其他工程化纳米颗粒）的最新创新，有助于提高佐剂活性、疫苗免疫原性和安全性（17–19）。在这些努力中，包括旨在通过直接靶向递送到保护性免疫应答协调部位的引流淋巴结（draining lymph nodes， LNs）来增强疫苗生物分布和效力的技术（20）。其中一种方法是“白蛋白搭载”（albumin-hitchhiking），它利用白蛋白依赖大小的（~65 kDa）淋巴系统迁移，将疫苗积聚在引流淋巴结中（21， 22）。由此产生的靶向生物利用度以及抗原和佐剂被APCs摄取的增加，从而启动了强大的适应性免疫应答。因此，为了允许与白蛋白瞬时结合，抗原和佐剂可以用白蛋白结合部分进行化学修饰（23–25）。研究人员特别关注两亲性脂质聚合物[Amphiphile（AMP）]缀合物的临床前和临床开发，其中感兴趣的分子有效载荷与白蛋白结合的磷脂尾部相连，使其在注射到组织后能够与内源性白蛋白非共价结合，从而通过淋巴系统有效地靶向引流淋巴结。先前已在小鼠和非人灵长类动物（NHPs）中证明，AMP缀合物能够优化体内生物分布并防止TLR9激动剂CpG-7909在严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）疫苗接种背景下的全身毒性，同时产生强大、长期的细胞和体液免疫（26， 27）。此外，ELI-002是一种靶向驱动结直肠癌和胰腺癌的突变KRAS抗原的AMP-CpG佐剂肽疫苗，最近在I期临床试验（AMPLIFY-201； NCT04853017）和正在进行的I/II期试验（AMPLIFY-7P； NCT05726864）中进行了评估，显示AMP缀合的佐剂耐受性良好，并诱导了强大的抗肿瘤T细胞应答，与肿瘤生物标志物减少和人类无复发生存期延长相关（28， 29）。为了在此基础上进一步发展，研究人员寻求开发使用与CpG:TLR9不同信号通路的额外佐剂。病毒样DNA是一个有希望的候选物，因为它能强烈诱导炎症。细胞质和内体中含有大量核酸感知PRR（30），它们可以检测各种外源和宿主寡核苷酸，通过固有免疫系统产生强大的反应。然而，要将DNA用作疫苗佐剂，必须克服许多药物递送挑战，例如游离施用的DNA的细胞摄取可忽略不计、快速清除和细胞质通路差（31），这可能解释了迄今为止这些基于DNA的免疫刺激剂的发展受到限制的原因。因此，将DNA佐剂靶向递送至体内适当的固有免疫细胞，结合高效的细胞摄取，允许药理学激活同源PRR，将为引发强大免疫应答提供新的机会和巨大潜力。在本研究中，研究人员设计了一系列AMP工程化的DNA佐剂，能够在小鼠和NHPs中诱导针对共同施用的蛋白质亚单位抗原的强效CD8⁺和CD4⁺ T细胞免疫。AMP诱导的细胞免疫应答显著超过了未修饰的“可溶性”（SOL）DNA或市售佐剂佐剂疫苗的对照组。此外，AMP介导的中和免疫球蛋白G1（IgG1）的大量产生，伴随着TH1相关的IgG2c水平的升高，后者是一种已知可通过抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity， ADCC）和补体依赖性细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity， CDC）促进细胞免疫的同种型。在此之前，强烈的固有反应诱导产生了一个高度炎症性、淋巴结限制性的环境，导致PRR感知、抗原加工和抗原呈递能力增强。这些机制关键依赖于TANK结合激酶1（TBK1）/IFN-I信号轴，如通过TBK1缺失和IFNα受体-1（IFNα receptor-1， IFNAR1）阻断所证实，并且在较小程度上依赖于TLR介导的以及RNA感知通路，如通过Unc-93同源物B1（Unc-93 homolog B1， Unc93b1）和线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral-signaling protein， MAVS）缺失所证实。总体而言，本研究证明了AMP-DNA佐剂刺激强大细胞和体液免疫应答的能力，并强调了AMP修饰在将原本无效的佐剂有效递送至目标部位以增强其免疫原性方面的多功能性。

AMP-DNA是一种强效且安全的佐剂，可在小鼠中诱导针对蛋白质亚单位抗原的T细胞和抗体应答。DNA佐剂的设计目的是通过激活核酸感知PRR来刺激固有免疫激活。研究人员评估了多个设计参数，包括DNA 5' AMP修饰、DNA单双链性以及寡核苷酸序列、长度和骨架连接化学。为了评估AMP修饰对DNA佐剂免疫原性的重要性，研究人员首先合成了硫代磷酸（phosphorothioate， PS）骨架、单链或双链AMP-DNA，包括一个5'二酰基磷脂缀合的、单链50聚胸苷寡脱氧核苷酸（AMP-dT50），或与其互补的、未缀合的聚脱氧腺苷链退火（AMP-dT50 + dA50 → AMP-dA:dT50；图1A和图S1A）。这些与相应的未修饰SOL DNA类似物进行了比较。DNA佐剂与卵清蛋白（ovalbumin， OVA）（一种常用于基准测试相对疫苗免疫原性的研究抗原）或SARS-CoV-2 WH-01变异株刺突蛋白受体结合域（WH-01 RBD）（代表一个高度相关的公共卫生关注抗原）混合（图1B）。皮下免疫显示疫苗成分从注射部位特异性地共同迁移至引流淋巴结并被APCs摄取（图S2）。注射遵循初免-加强方案，剂量在第0天和第14天给予（图1C）。七天后，即第21天，通过分析代表淋巴结局部启动后系统性反应的脾脏T细胞来确定细胞免疫，而体液免疫分析则在血液样本中进行。用AMP-DNA和OVA免疫导致脾脏IFNγ斑点形成细胞（spot-forming cells， SFCs）的平均数量较其未修饰对应物分别增加了七倍（AMP-dA:dT50， 3962 SFCs/1 × 10⁶）和41倍（AMP-dT50， 6934 SFCs/1 × 10⁶），而未修饰对应物显示的信号与模拟处理的小鼠无显著差异（图1D）。此外，这些应答是多功能性的，与SOL疫苗（诱导的反应与模拟处理相当）相比，抗原特异性IFNγ（198倍）、肿瘤坏死因子-α（TNFα； 19倍）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF； 108倍）、白细胞介素-2（interleukin-2， IL2； 5倍）和颗粒酶B（granzyme B， GzmB； 44倍）的分泌显著增加（图1， E和F）。直接对未经体外刺激的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells， PBMCs）进行四聚体染色显示，AMP-dA:dT50或AMP-dT50免疫分别诱导了54%和70%的循环CD8⁺ T细胞识别免疫显性OVA表位SIINFEKL（图1G和图S3A）。引流淋巴结驻留免疫细胞的结果证实，用AMP-DNA佐剂免疫后，针对SIINFEKL产生了强效、抗原特异性的T细胞免疫诱导（图S1， B和C）。此外，PBMCs的胞内细胞因子染色（intracellular cytokine staining， ICS）显示，CD8⁺和CD4⁺ T细胞是细胞因子分泌的关键贡献者，超过60%的CD8⁺ T细胞主动产生IFNγ和TNFα（图1， H和I，以及图S1D）。从灌注的肺组织中分离的T细胞中也观察到类似结果（图S1， E和F），肺组织是病原体的常见入口点和肿瘤转移的主要器官。在仅用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）-载体再刺激的AMP-dT50加OVA处理动物的样本中，或在未接种OVA抗原的AMP-dT50免疫小鼠中，未检测到反应（图1G和图S3C），证明观察到的免疫应答是抗原特异性的（门控策略见图S3， D和E）。除了强大的细胞反应外，AMP修饰的佐剂还产生了高血清IgG滴度（图1J）。虽然SOL组产生了相当的OVA特异性抗体水平，但这是在缺乏强大细胞免疫激活的情况下发生的。这可能表明，虽然用可溶性、未修饰的DNA佐剂可以实现体液应答，但AMP-DNA佐剂为克服更强效细胞应答激活的严格阈值提供了特定优势。针对RBD抗原观察到了类似的结果（图S4）。在这里，AMP-dA:dT50和AMP-dT50较其SOL DNA佐剂对照组分别使脾脏IFNγ分泌增强了七倍和12倍（图S4B），并导致循环CD8⁺ T细胞中65%和85%产生抗原特异性细胞因子（图S4D）；可溶性对照组无活性。用AMP-DNA免疫未观察到不良体重变化或全身细胞因子水平，参与细胞因子释放综合征的主要细胞因子，即IL1/2/6/10、IFNγ、GM-CSF和TNFα，在血清中未检测到高水平（图S5）。肌肉内免疫显示的免疫应答与皮下注射相当（图S6）。这些数据共同说明了AMP-DNA作为一种强效且安全的疫苗佐剂的潜力，能够产生强大的细胞和体液免疫应答。

AMP-DNA佐剂的免疫原性取决于关键的物理和化学特性。为了确定除了AMP修饰之外决定AMP-DNA佐剂最佳免疫原性的额外物理和化学特性，研究人员系统性地改变了剩余的四个初始设计参数（图2A），以确定它们对最终免疫应答的贡献。通过测量脾脏T细胞中的抗原特异性IFNγ分泌来确定免疫原性。检查DNA单双链性表明，单链和双链DNA都能在抗原特异性T细胞中诱导强大的细胞因子产生。虽然单链AMP-dT50比其双链AMP-dA:dT50变体产生更强的免疫应答（图2B），但另外两种公认的免疫刺激性ODN（32），单纯疱疹病毒60（herpes simplex virus 60， HSV60）和单核细胞增生性李斯特菌来源的IFN刺激性DNA（IFN-stimulatory DNA， ISD），在AMP缀合后以任一形式表现同样出色。因此，对于依赖于DNA序列的佐剂识别而言，单双链性可能不是一个关键特征（图2， C和D）。这些结果还表明，细胞DNA感知可能在很大程度上与序列无关，因为对所有上述序列都观察到了显著的应答。相比之下，单链聚脱氧腺苷（AMP-dA50）以及AMP-dT:dA50（其中AMP修饰在dA链上）无法产生强大的免疫应答（图2B）。然而，由交替的胸苷和腺苷碱基组成的ODN（dAdT:dAdT50）能够显著挽救免疫应答（图S7），这表明存在某些序列要求，并且含有胸苷的序列可能是相关DNA感知PRR的首选。另一个已知决定PRR检测DNA的关键因素是ODN长度（32）。对AMP和SOL DNA的序列长度进行系统变化显示，短于30个核苷酸的序列无法产生T细胞应答（图2， E和F），表明参与的PRR需要一个最小序列长度来传递危险信号。然而，将DNA长度从30个核苷酸增加到50个核苷酸并没有带来额外的益处。最后，将合成的PS键替换为天然存在的磷酸二酯（phosphodiester， PO）键消除了所有细胞免疫应答（图2， G和H），这可能是由于PO键在体内稳定性差，容易被核酸酶降解。总体而言，这些数据表明最佳的单链或双链AMP-DNA佐剂应包含30到50个PS连接的核苷酸，其中含有足够数量的胸苷以实现有效的PRR识别。

为了进一步阐明佐剂设计对免疫原性的重要性，研究人员进行了体内成像分析，其中DNA在3'端缀合了Cy5荧光标签，以分析注射后佐剂的生物分布。选择了长度为50和20个核苷酸的dT变体，分别代表具有强效免疫原性活性或完全缺乏活性的例子。正如预期的那样，鉴于其水动力学尺寸（>10 nm），SOL和AMP-dT50都有效地积聚在腹股沟淋巴结中（13），而较短的SOL dT20则未能做到这一点（图S8， A至C）。然而，AMP修饰能够恢复AMP-dT20的高效递送，这与先前对类似大小的CpG-7909的观察一致（23）。这表明小尺寸的DNA分子作为佐剂效果较差，部分原因是它们未经靶向的全身分布，只有少量到达淋巴结内的免疫学相关细胞。此外，免疫激活需要足够的DNA长度，因为即使AMP-dT20有效地到达淋巴结，它也无法刺激免疫应答（图2E）。值得注意的是，尽管SOL dT50和SOL dA:dT50（图S8， D和E）到达了淋巴结且长度足够，但它们都无法引发应答。因此，AMP修饰可能促进了除淋巴结递送之外的、对免疫激活至关重要的额外机制：APCs的细胞摄取改善、导致增强的细胞质PRR通路的内涵体逃逸，或其他促进同源PRR结合的机制，是未来研究中极具兴趣的关键因素。

AMP-DNA佐剂能产生高度持久的记忆应答，并具有显著的召回潜力。为了确定这些强大的急性应答是否转化为持久的免疫记忆，研究人员进行了纵向研究，在初免-加强免疫后对动物进行了长达9个月的追踪。用AMP-DNA和RBD抗原免疫的小鼠在整个研究期间显示出稳定的RBD特异性外周血T细胞群体，在RBD肽刺激下，超过31%的CD8⁺ T细胞产生细胞因子（图3A），超过12%的细胞表达针对RBD的VNFNFNGL表位的特异性T细胞受体（T cell receptors， TCRs）（图3B）。在超过239天的时间里，RBD特异性CD8⁺ T细胞从主要是效应和/或效应记忆表型（CD44⁺/CD62L^-）转变为主要是（62%）中央记忆表型（CD44⁺/CD62L⁺；图3C）。在第244天接触抗原回忆暴露后，这些细胞很容易转回效应和/或效应记忆T细胞。这种回忆应答使分泌细胞因子的效应T细胞群体反弹至循环CD8⁺ T细胞的55%，并将VNFNFNGL特异性T细胞扩增至35%（图3， A和B）。在脾细胞中也观察到效应T细胞扩增，其中产生细胞因子的细胞数量在对RBD抗原反应时加倍（21，300 SFCs/10⁶脾细胞），而未受攻击的同窝对照为10，700 SFCs/10⁶（图3D）。由于中央记忆细胞通常归巢至次级淋巴组织，研究人员检查了这些记忆细胞在淋巴结中的富集情况。在小鼠用AMP-dT50免疫9个月后，所有淋巴结驻留CD8⁺ T细胞中有5.8%是RBD特异性中央记忆细胞，为抗原遭遇时重新动员提供了重要的细胞库（图3E）。在AMP-dA:dT50处理的小鼠中观察到相同的趋势（图S9， A至D）。尽管有这些强大且持久的应答，但效应和/或效应记忆细胞没有表现出任何衰竭迹象（图S9E）。由于CD4⁺ T细胞促进细胞和体液应答，研究人员也研究了它们的激活状态。这些细胞遵循与CD8⁺ T细胞相似的趋势，在记忆应答阶段与SOL DNA处理的动物相比，建立了显著数量的平台期。在抗原回忆后，CD4⁺ T细胞水平超过了急性期观察到的水平（图S9， F和G）。在使用OVA的模型中也证实了这些针对RBD的细胞长期应答（图S9， H和I）。此外，对这些小鼠中抗OVA抗体滴度的纵向分析显示了与细胞应答中观察到的类似趋势。在整个研究期间，IgG抗体水平维持在高浓度，在第218天抗原攻击后显著反弹，并与用Alhydrogel [氢氧化铝凝胶（alum）]处理的动物相当，后者是一种以诱导强大体液应答而闻名的佐剂（图S10）。这些数据表明，AMP-DNA佐剂有潜力产生持久的细胞和体液记忆应答，这些应答可以在检测到后续抗原暴露时迅速扩增。

AMP-DNA相较于临床基准佐剂能诱导更强的细胞免疫和强大的体液免疫原性。为了测试AMP-DNA佐剂与市售和/或临床使用佐剂的比较，研究人员选择了一个包含人类可用常见疫苗佐剂实例的对照组。这些基准对照包括alum；一组油包水乳剂，包括不完全弗氏佐剂（incomplete Freund’s adjuvant， IFA）、AddaVax（MF59类似物）和AddaS03（AS03类似物）；TLR4激动剂单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A， MPLA；一种脂多糖衍生物）；以及poly(I:C)（4， 33）。AMP-CpG-7909也包含在该对照组中，以比较AMP缀合的佐剂。AMP-DNA在细胞应答方面始终显著高于任何基准佐剂甚至AMP-CpG-7909。AMP-dT50和AMP-dA:dT50均产生了更多的循环抗原特异性CD8⁺ T细胞（图4A），并在外周血、脾脏和灌注的肺样本中增加了产生细胞因子的CD8⁺和CD4⁺ T细胞的频率（图4， B至F，以及图S11），而基准对照组未引发任何显著的细胞免疫。相比之下，所有佐剂都能产生高滴度的抗OVA血清IgG（图4G）。然而，对特定IgG亚型，即IgG1和IgG2c [C57BL/6小鼠中的IgG2a同源物； (34)]的更详细分析显示了同种型谱的差异。虽然主要功能是中和可溶性抗原的IgG1滴度在所有测试的佐剂组中相当，但AMP-DNA和AMP-CpG疫苗产生了高出一到两个数量级的IgG2c水平，后者是一种IFNγ诱导的同种型，能强烈促进补体固定和ADCC（图4， H至J）（35）。这与这些小鼠中效应T细胞产生的显著水平的IFNγ一致。这证明了AMP缀合的DNA佐剂能够将强大的体液免疫与强效的细胞免疫激活相结合。

在NHP中，AMP-dT50对多种关注变异株（variants of concern， VOC）的RBD诱导了交叉保护性的细胞和体液免疫应答。受到AMP-DNA在小鼠中引发的免疫应答的鼓舞，研究人员在恒河猴NHP中使用相关的SARS-CoV-2模型评估了AMP-dT50的活性，以预测人类可能的反应。三只成年雌性恒河猴在第0周（基线）和第4周大腿上部皮下接种WH-01 RBD蛋白与AMP-dT50混合物；按照图5A所示收集PBMCs、血清和淋巴结细针穿刺抽吸物（fine-needle aspirates， FNAs）用于分析细胞和体液免疫。在第6周，即加强剂后2周，所有三只动物在用WH-01 RBD重叠肽（overlapping peptides， OLPs）刺激后，外周血T细胞中IFNγ SFC的频率较接种前基线值显著增加（图5B）。此外，CD4⁺ T细胞的IFNγ、TNFα和IL2细胞因子产生显著增加，CD8⁺ T细胞的应答与基线相比也有所提高（图5， C和D）。当用VOCs Beta和Delta RBD的OLPs刺激来自WH-01免疫动物的PBMCs时，观察到类似的细胞应答（图S12， A至C），这表明AMP-dT50能够对可能对不同SARS-CoV-2毒株保护很重要的保守表位产生强大的细胞应答。为了研究体液应答，从治疗前基线开始每两周收集一次血清样本（图5E）。通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）评估WH-01 RBD特异性IgG水平，并转换为世界卫生组织（World Health Organization， WHO）结合抗体单位（binding antibody units， BAU）/毫升。所有三只动物在仅一次免疫后就出现了血清转化，抗RBD特异性IgG浓度显著增加，并在第二次剂量后2周达到峰值水平。在整个评估研究期间，抗体滴度保持升高。当检测针对Beta、Delta和Omicron RBD变体的抗体应答时，观察到相同的趋势（图S12， D和E），证实了AMP-dT50佐剂可能对多种VOC产生交叉保护性免疫的观点。为了确定这些抗体应答是否能够提供中和免疫，研究人员评估了假病毒抑制活性（图5F和图S12， F和G）。所有动物的抗体应答对测试的VOC提供了中和保护，其半数感染剂量（median infective dose， ID₅₀）值显著高于最近从SARS-Co-2感染中恢复的康复期患者血浆（convalescent human plasma， CHP），这表明AMP-dT50诱导的免疫可能超过人类自然感染产生的应答水平。这种体液应答与这些动物中强大的生发中心（germinal center， GC）形成直接相关，这通过流式细胞术分析淋巴结FNAs中GC B细胞（CD20⁺ BcL6⁺ Ki-67⁺）对RBD抗原的特异性得以确定（图5G），这是亲和力成熟和产生高特异性抗体的先决条件。这种AMP-dT50佐剂SARS-CoV-2疫苗的免疫原性并未伴随临床评估可观察到的明显不良反应（体温、体重和注射部位观察；图S13， A和B）。血清细胞因子水平（图S13C）和全血细胞计数（图S13， D至H）在施用AMP-dT50后短暂波动（IFNγ、IL1RA和IL18），但在1到2天后恢复正常。IL18水平的升高可能提示NHP中涉及了炎性小体途径，而在小鼠中已证明该途径不起作用。综合来看，在NHP中观察到的强大细胞和体液反应以及最小的不良反应，加上使用类似AMP缀合的CpG佐剂的临床数据（28），表明AMP-DNA佐剂在未来临床研究中具有应用前景。

AMP-DNA在小鼠和NHP的引流淋巴结中促进了一个高度免疫刺激性的微环境。AMP佐剂的免疫原性改善与其增强的向引流淋巴结的递送相关（23， 24）。为了阐明淋巴结内促进AMP-DNA诱导免疫的机制，研究人员使用NanoString评估了小鼠和NHP中超过500个免疫相关基因转录本的全面谱系。小鼠单次接种WH-01 RBD抗原和dT50 DNA；随后在指定时间收集腹股沟淋巴结进行转录组评估（图6A）。在6小时后，用AMP-dT50处理的小鼠显示出数十个对启动有效固有免疫应答至关重要的转录本的急性上调（图S14， A至C）。上调的基因包括与APCs向淋巴结募集相关的趋化因子、APC谱系和激活标记物、PRRs以及促进抗原加工和呈递的转录本，与专业APCs流入和随后强大的固有免疫一致。相比之下，用SOL dT50处理的小鼠表现出更加受限的转录特征，仅限于少数趋化因子。AMP-dT50免疫24小时后，最初的固有免疫反应发展成一个完全成熟的促炎环境，具有对适应性免疫至关重要的多个免疫通路激活轴，而SOL dT50未能做到这一点（图6， B至D，以及图S14D）。特别值得关注的是基因谱显示增强的活化APCs功能，包括识别危险信号（例如，Tbk1， Ddx58 [视黄酸诱导基因I（retinoic acid-inducible gene I， RIG-I）]， Ifih1 [黑色素瘤分化相关蛋白5（melanoma differentiation-associated protein 5， MDA5）]， Tlr3， Tlr9， 和MyD88）、加工和呈递抗原（例如，H2-k1， Tap1， B2m， Psmb9/10， Ctss， 和Ctsc）、共刺激T细胞（例如，Cd80， Cd86， 和Cd40）、通过细胞因子传递信号（例如，Tnfa， Il18， Stat2/3， 和Jak2），以及诱导许多抗病毒干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes， ISGs），如Irf、Ifi和Ddx家族基因等。在AMP-dT50给药后72小时，这种炎症反应已经消退，PRRs以及细胞因子和趋化因子水平恢复到基线（图S14， E至G）。尽管如此，大量表达CD11b（Itgam）转录本的细胞仍然留在淋巴结中。在这些早期时间点，未观察到与未处理组相比T细胞总体群增加的转录本升高。值得注意的是，SOL dT50处理的淋巴结的转录组在72小时时间点开始出现B细胞相关特征（Cd19/22/79a/81， Btk， 和Pax5）（图S14E），与在这些动物中观察到的主要是体液反应相对应（图1H）。在NHP中接种WH-01 RBD与AMP-dT50混合物后也观察到类似结果。收集的淋巴结的转录组分析显示，在AMP-dT50给药后24小时，多种趋化因子和细胞黏附分子的转录本较接种前基线值上调，提示固有免疫细胞流入（图S15， A和B）。在48小时后，接着是广泛促炎通路的进一步增强（图6， E和F，以及图S15， C和D）。淋巴结中各种APCs（包括树突状细胞（dendritic cells， DCs）和巨噬细胞[Fcgr3 (CD16), Fcgr2a/b (CD32), Fcgr1a (CD64), Itgam (CD11b), 和Itgax (CD11c)]转录特征的增加，与高度抗病毒环境（Oas1/2/3, Ifit1/2/3, 和Irf5/7）相关，该环境对核苷酸检测敏感[Ddx58 (RIG-I), Ddx60, Ifih1 (MDA5), Mb21d1 (cGas), 和OasL]。这些转录特征与在NHP中AMP-DNA免疫观察到的适应性免疫应答发展的促炎微环境一致（图5）。在小鼠和NHP中，AMP-dT50激活了将初始淋巴结转化为促炎热点所需的大量共同免疫通路（图S15E）。将这些转录模式与免疫原性相关联，进一步突出了在这种支持强大免疫激活的特殊器官中激活固有免疫的重要性。

AMP-DNA在引流淋巴结中有效诱导依赖于IFN-I信号通路的炎症细胞因子应答。鉴于AMP-DNA接种后在淋巴结中观察到的免疫刺激性转录程序的显著诱导，研究人员研究了这些是否有效地转化为淋巴结内蛋白质组谱的变化。小鼠单次接种WH-01 RBD和AMP-dT50或AMP-dA:dT50或其相应的可溶性对应物，并在6或24小时后收集引流淋巴结进行多重蛋白质组学分析。AMP-dT50处理的动物（图7A和图S16）在24小时时间点，几乎所有测试的细胞因子的产生都较模拟处理或SOL dT50处理的小鼠显著增加，与该时间点的mRNA转录水平一致。这些细胞因子包括（i）生长因子（粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor， G-CSF）、GM-CSF和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor， M-CSF））、（ii）促炎细胞因子（IFNγ， TNFα， 和IL6）、（iii）趋化因子[干扰素γ诱导的10 kDa蛋白（interferon-gamma induced protein 10 kDa， IP-10）、IL8、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1， MCP1）、巨噬细胞炎症蛋白-1（macrophage inflammatory protein-1， MIP1α/β）和干扰素γ诱导的单核因子（monokine induced by gamma interferon， MIG）]、（iv）炎性小体相关细胞因子（IL1β和IL18）以及（v）IFN-I，与上述ISG特征一致。类似地，接种AMP-dA:dT50的小鼠（图S17）在24小时有高水平的细胞因子产生，但似乎比单链形式更早启动产生。相比之下，SOL dA:dT50处理的淋巴结细胞因子水平显著低于AMP组，尽管显示出较基线可检测到的细胞因子上调，但未达到足以诱导有效下游免疫诱导的水平（图1）。

AMP-dT50在引流淋巴结中有效诱导的炎症蛋白组学环境依赖于IFN-I信号通路。特别值得注意的是AMP-DNA介导的IFN-I的强烈诱导，IFN-I是病原体初始检测后强大免疫激活的重要介质（36， 37）。为了研究其在AMP-DNA诱导的免疫激活中的作用，研究人员在免疫WH-01 RBD和AMP-dT50前24小时，使用抗IFNAR1抗体在小鼠中阻断了IFN-I信号所必需的IFNAR1（图7B）。这导致随后免疫反应几乎完全消除。评估引流淋巴结中的细胞因子水平显示，与用同型对照抗体处理的小鼠相比，几乎所有分析物都显著减少（图7B和图S18， A至D），导致脾脏、外周血和灌注肺中的T细胞应答显著减弱（图7C和图S18， E至H）。只有体液应答受IFNAR1阻断的影响相对较小，这由对WH-01 RBD的抗体滴度测定（图S18I）。在用AMP-dA:dT50免疫的小鼠中观察到类似结果（图S19）。在使用IFNAR敲除（knockout， KO）小鼠的实验中证实了IFN-I信号在AMP-DNA诱导的免疫应答中的关键作用，其中适应性免疫反应与IFNAR充足的小鼠相比几乎完全消除（图7D）。这些数据表明，AMP-DNA佐剂在淋巴结中诱导了一个富含多种促炎细胞因子的环境，其中IFN-I在传导AMP-DNA信号以导向适应性免疫方面发挥着关键作用。

AMP-DNA佐剂需要TBK1信号传导。当核酸被细胞内或内体PRRs检测时，可以诱导强大的IFN-I反应（37）。通常，检测核酸的主要PRR途径包括炎性小体（控制IL1和IL18的蛋白水解成熟，通过如黑色素瘤缺失基因2（absent in melanoma 2， AIM2）等受体）；检测DNA的各种细胞质传感器[例如，cGas、干扰素γ诱导蛋白16（interferon-gamma inducible protein 16， IFI16）和DNA依赖性干扰素调节因子激活因子（DNA-dependent activator of interferon-regulatory factors， DAI）]和RNA（MDA5和RIG-I），它们分别通过STING和MAVS传递信号，并激活TBK1/干扰素调节因子（interferon regulatory factor， IRF）和IκB激酶（IκB kinase， IKK）/核因子κB（nuclear factor κB， NFκB）；以及内体TLRs，它们通过MyD88或含TIR结构域的适配体诱导干扰素β（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon β， TRIF）传递信号，最终也可汇聚到TBK1和IKK通路（38–41）。TBK1/IRF轴是IFN-I转录的主要调节因子。为了确定AMP-DNA诱导的免疫激活是否依赖于TBK1信号传导，研究人员使用了在造血细胞特异性Vav1启动子下表达Cre重组酶的TBK1条件性敲除小鼠（TBK1fl/flVav-iCre），并用OVA和AMP-dT50对其进行了两次免疫。在造血区室缺失TBK1的小鼠（TBK1fl/flVav-iCre）产生脾脏IFNγ SFC的能力显著减弱（图8A），并且循环中产生细胞因子的CD8⁺ T细胞频率显著降低（图8B），表明AMP-DNA需要TBK1信号传导来诱导细胞免疫应答。为了进一步阐明上游TBK1的哪些传感器负责检测AMP-DNA，研究人员用AMP-DNA和抗原免疫了多种PRR通路KO小鼠模型。与STING充足的小鼠相比，STING-KO小鼠的细胞因子产生的CD8⁺ T细胞没有显著减少（图S20A），并且其淋巴结中的蛋白质组炎症环境相似（图S20B）。相比之下，缺失Unc93b1（对内体TLRs如TLR3/7-9/11-13的正确表达至关重要（42），并且已知会导致缺陷个体患疱疹性脑炎（43））导致循环中分泌TNFα和IFNγ的CD8⁺ T细胞减少52%（图8C）。TLR9缺失导致CD8⁺ T细胞的细胞因子反应减少了23%，这并未完全重现Unc93b1缺失的结果，表明可能还有其他TLR参与AMP-DNA的感知（图8D）。此外，MAVS缺失也导致免疫反应显著但较小的减弱，使分泌细胞因子的CD8⁺ T细胞数量减少了21%（图8E），而AIM2缺失没有影响（图S20， C和D）。总体而言，这些数据表明AMP-DNA佐剂可能主要由内体TLRs感知，但也可能使用涉及RNA聚合酶III转录和通过MAVS传递信号的次要途径。这些途径最终汇聚到TBK1的激活，后者能够在APCs中诱导强大的IFN-I反应，从而刺激强大的适应性免疫。