对Deeplex Myc-TB靶向性下一代测序检测方法在分枝杆菌鉴定与耐药检测中的评估

《Journal of Clinical Microbiology》：Evaluation of the deeplex Myc-TB-targeted next-generation sequencing assay for mycobacterial identification and drug resistance detection

结核分枝杆菌复合群（MTBC）与非结核分枝杆菌（NTM）的精准鉴别以及耐药性的早期检测，对于指导治疗和感染控制至关重要。靶向性下一代测序（tNGS）检测方法，例如Deeplex Myc-TB（GenoScreen，法国里尔），能够同时进行物种鉴定和耐药突变检测。研究人员在2024年5月至2025年3月期间收集的304份初代培养阳性分枝杆菌生长指示管（MGIT）肉汤标本上评估了Deeplex Myc-TB。该检测方法对273份分离株产生了确定结果，包括29株MTBC和244株NTM，MTBC鉴定的一致率为100%，NTM为98.8%。MTBC鉴定使用GeneXpert MTB/RIF，而表型药物敏感性检测（pDST）采用Sensititre MYCOTB肉汤微量稀释法或基于MGIT的检测板。在29株独特的MTBC分离株中，18株（62.1%）未检测到耐药突变（DRMs）。表型药物敏感性检测确认这18株对所有测试药物均敏感，与Deeplex预测的敏感性结果完全一致，未发现异质耐药。其余11株（37.9%）携带至少一个DRM，其中7株包含已知赋予耐药性的突变。对于携带已知赋予耐药性突变且具有临床实验室标准化协会（CLSI）折点可用的分离株，基因型判定与pDST结果一致，其中1例符合耐多药结核病标准。所有244株NTM分离株均事先通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定；Deeplex确认了这些鉴定结果，并在鸟分枝杆菌复合群和脓肿分枝杆菌内提供了亚种水平的分辨率。这些研究结果证明了Deeplex Myc-TB在高分辨率MTBC耐药谱分析和精准NTM物种及亚种鉴定方面的强大诊断潜力。将靶向测序整合到常规工作流程中可以改善临床决策、支持早期治疗优化，并加强分枝杆菌疾病的分子监测。

**研究背景与问题**
结核分枝杆菌复合群（MTBC）仍是全球发病率和死亡率的主要原因之一，但其诊断流程受限于该病原体缓慢且苛刻的生长特性。作为长期参考标准的基于培养的表型药物敏感性检测（pDST）通常需要约30天才能获得结果，这延迟了治疗启动并持续了传播。以Xpert MTB/RIF为代表的部分分子检测方法虽然能在数小时内快速检测MTBC和利福平（RIF）耐药性，但其检测范围仅限于单一耐药靶点，无法提供全面的耐药谱分析或鉴定非结核分枝杆菌（NTM）。NTM是一个包含超过200个物种的异质性群体，治疗方案因物种和亚种而异，因此准确、及时的鉴定至关重要。然而，常规方法往往缺乏临床决策所需的速度和鉴别力。耐药结核病的出现进一步凸显了先进诊断技术的必要性。世界卫生组织（WHO）全球结核病报告估计，2022年全球约有41万例耐多药或利福平耐药结核病（MDR/RR-TB）新发病例。尽管美国总体结核病负担低于高负担地区，但耐药结核病在移民和免疫功能低下人群中仍是公共卫生威胁，同时NTM感染也日益被认识。因此，需要快速、准确的工具来同时检测MTBC耐药性和鉴定NTM物种，以改善患者预后并为美国医疗环境中的感染控制策略提供信息。靶向性下一代测序（tNGS）通过鉴定分枝杆菌基因组中与耐药相关的基因座提供了一个实用的解决方案。Deeplex Myc-TB是tNGS中最先进的应用之一，已在非洲、亚洲和欧洲的国家调查和参考实验室中使用直接痰液和培养分离株进行了评估，显示出与pDST在一线和二线药物上的高度一致性。该平台可同时预测13种抗结核药物或药物类别的耐药性、进行MTBC基因分型和识别NTM物种。最近，WHO的评估认为Deeplex Myc-TB是唯一一个满足所有评估药物性能标准的tNGS检测方法。本研究旨在描述将Deeplex Myc-TB整合到临床分枝杆菌学实验室的过程，并在真实世界条件下评估其诊断性能，特别关注其与GeneXpert MTB/RIF和pDST在MTBC鉴定和耐药预测方面的一致性，以及与MALDI-TOF MS在NTM鉴定方面的一致性，从而为美国三级医疗中心分枝杆菌诊断中整合靶向性下一代测序检测提供实用数据。
**关键技术方法**
研究人员在约翰·霍普金斯大学临床分枝杆菌学实验室，对2024年5月至2025年3月间，从自动化培养检测系统（MGIT-960）获得的抗酸杆菌（AFB）阳性培养物进行了评估。经GeneXpert MTB/RIF确认为MTBC阳性的MGIT肉汤标本被纳入Deeplex Myc-TB检测，以评估MTBC鉴定、利福平耐药预测与pDST的一致性。对于GeneXpert确认为阴性的NTM分离株，则使用MALDI-TOF MS进行鉴定，评分>1.8的分离株随后进行Deeplex Myc-TB检测。关键的Deeplex Myc-TB检测流程包括：使用KingFisher Duo仪器进行DNA提取，随后使用试剂盒提供的引物进行多重PCR扩增，在Illumina iSeq平台上进行文库构建和测序，测序数据通过制造商提供的安全网络应用程序进行分析，该程序将读数与精选的分枝杆菌参考数据库比对，报告MTBC谱系、NTM物种/亚种以及MTBC的耐药突变。所有样本的队列来源均为临床常规工作流程中生成的304份初代培养阳性MGIT肉汤标本。
**研究结果**
**MTBC的鉴定与耐药分析**
在304份接受Deeplex Myc-TB检测的培养物中，273份（89.8%）符合质量标准并纳入最终分析，包括29株MTBC和244株NTM。所有29株GeneXpert阳性MTBC分离株也被Deeplex鉴定为MTBC，两方法在MTBC鉴定上的一致性达到100%。在这29株MTBC分离株中，18株（62.1%）在所有靶向基因中未检测到Deeplex检出的耐药突变（DRMs）。对这18株的pDST确认其对所有测试药物均敏感，与Deeplex预测的敏感性完全一致。未在MTBC分离株中检测到异质耐药。其余11株（37.9%）携带Deeplex检测到的基因型突变。其中，7株（24.1%）携带至少一个已知意义的突变，7株（24.1%）携带至少一个不确定意义的突变，3株（10.3%）同时携带两类突变。在pDST和解释标准可用的情况下，仅携带不确定意义变异的分离株在表型上表现为敏感。对于携带已知赋予耐药性突变（如异烟肼（INH）耐药相关的 inhA (S94A)、katG (S315T) 或 fabG1 (c-15t)；利福平耐药相关的 rpoB (S450L)；乙胺丁醇（EMB）耐药相关的 embB (M306I)；吡嗪酰胺（PZA）耐药相关的 pncA (H57D)）且CLSI折点可用的分离株，基因型判定与表型结果一致。有4株分离株根据Deeplex预测为单药耐药（3株INH耐药，1株PZA耐药），均与pDST一致。其中1株分离株（15号）符合耐多药结核病（MDR-TB）标准，Deeplex和pDST均确认其对RIF和INH耐药；该分离株对EMB也耐药。此外，该株还携带了 rpsL (K43R) 和 ethA (delA) 突变，但未进行链霉素（STM）和乙硫异烟胺（ETH）的pDST。在携带已知赋予耐药性突变且表型折点可用的情况下，基因型与表型结果一致。多个分离株携带意义不确定的Deeplex标记突变（如 rpoB (E291D, G217S, V496A), gyrA (V55M), ahpC (g-123a, g-142a), katG (G186N), rrl (G2399A), ethA (S266R), gidB (delG/del)）。当这些不确定意义变异存在且CLSI折点可用时（如 rpoB E291D 和 G217S），MIC值仍在敏感范围内。当CLSI折点未定义或测试未执行时（如FQ、ETH、LZD），则无法进行分类判定。
**NTM的物种鉴定**
在MALDI-TOF MS鉴定为NTM的244个分离株中，Deeplex Myc-TB在有确定物种判定的分离株上与MALDI-TOF MS的一致率达到98.8%（241/244）。Deeplex Myc-TB的鉴定结果显示，鸟分枝杆菌复合群（MAC）最为常见，占164株（68.0%）。在MAC内，最频繁的类群是胞内分枝杆菌（M. intracellulare）亚种（包括subsp. intracellulare和subsp. chimaera）和鸟分枝杆菌（M. avium）。脓肿分枝杆菌（M. abscessus）复合群占64株（26.6%），包括脓肿分枝杆菌亚种脓肿亚种和马赛亚种。其他较少见的物种包括偶发分枝杆菌复合群等。三株分离株在初始Deeplex Myc-TB检测与MALDI-TOF MS鉴定上不一致，经复核或后续方法（如16S测序）确认了MALDI-TOF MS的结果，这突显了单次比较的局限性以及某些情况可能需要额外的实验室检测。
**讨论部分总结**
本研究表明，Deeplex Myc-TB能够支持常规分枝杆菌学检测，提供准确的MTBC基因分型以及高分辨率的非结核分枝杆菌鉴定。研究中约10.2%的培养物因结果无法解释（如污染、运行失败、测序覆盖度不足等）而被排除，这反映了该检测作为基于培养的批量检测方法在实际应用中的情况。在可解释的结果中，Deeplex Myc-TB作为MTBC培养物的快速前端分子筛查工具表现出色，能够识别经验证的耐药突变并标记可能敏感的病例以优化报告流程。其对MTBC的鉴定与GeneXpert MTB/RIF完全一致，对经典耐药突变的检测与pDST结果相符。对于意义不确定的变异，它们的存在不应用于调整治疗，但为流行病学监测和未来解读提供了数据。对于NTM，Deeplex Myc-TB在提供亚种水平分辨率方面（如区分MAC和脓肿分枝杆菌的亚种）具有重要临床价值，这有助于更精准的治疗和感染控制决策。然而，该研究也有局限性，包括单中心来源可能影响结果的普适性、缺乏临床数据关联、对某些药物（如新药、部分二线药）的表型解释不完整、以及对某些NTM物种亚种鉴定的准确性缺乏正交验证。在流行病学层面，Deeplex Myc-TB有助于深化对区域分枝杆菌多样性和耐药进化动态的理解，但其实施需要专门的基础设施和技术支持，这在资源有限的高负担国家可能受到限制。未来的工作应聚焦于扩展耐药标志物覆盖范围（尤其是新药相关标志物）、改善在低菌量标本中的性能，并将基因型与临床结局关联以校准预测模型。
**研究结论**
总之，Deeplex Myc-TB为同步检测MTBC和NTM提供了一个稳健、高分辨率的平台。其识别MTBC分离株、预测基因型耐药性以及准确分类NTM物种并提供亚种水平信息的能力，凸显了其作为临床微生物学中全面诊断和监测工具的价值。然而，该平台虽然扩展了我们的诊断目录，但绝不能取代pDST作为比较标准的必要性，特别是对于缺乏数据的未知突变。通过将高分辨率物种鉴定与与表型结果一致的基因型耐药判定相结合，Deeplex Myc-TB可以缩短获得有效治疗的时间，加强分子监测，并推进分枝杆菌感染的精准诊断和耐药性监测。