《Frontiers in Immunology》：The Sm29 antigen differentially shapes transcriptomic and regulatory landscapes across reactional forms of leprosy
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背景：已有文献表明曼氏血吸虫抗原能够诱导免疫应答，从而调节复杂疾病。相反，麻风病中失调的炎症反应会增加发病率，引发反应性发作，损害疾病进程。本研究旨在通过一项跨越不同临床反应形式——逆转反应（RR）、麻风结节性红斑（ENL）及无反应（WR）的转录组研究，评估曼
背景：已有文献表明曼氏血吸虫抗原能够诱导免疫应答，从而调节复杂疾病。相反，麻风病中失调的炎症反应会增加发病率，引发反应性发作，损害疾病进程。本研究旨在通过一项跨越不同临床反应形式——逆转反应（RR）、麻风结节性红斑（ENL）及无反应（WR）的转录组研究，评估曼氏血吸虫（Sm29）抗原在调节麻风病免疫应答方面的潜力。方法：培养并刺激外周血单个核细胞（PBMCs），使用超声处理的麻风分枝杆菌（M. leprae）抗原和重组Sm29（rSm29）抗原。总RNA采用TRIzol?（Ambion）按制造商方案提取。RNA文库使用TruSeq Stranded Total RNA Prep Globin kit（Illumina）构建，并通过KAPA Library Quantification Kit（Roche）进行定量PCR（qPCR）定量。测序在Nextseq 2000（Illumina）上进行，采用2x100碱基对（bp）读长。使用DESeq2分析差异表达，以鉴定各条件间的差异表达基因（DEGs）。鉴定出的DEGs通过 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行富集通路分析。结果：Sm29抗原能够调节麻风病中的免疫应答通路，且该反应在疾病的反应性形式中更为显著，尤其是在RR中。有趣的是，与超声处理的M. leprae相比，Sm29在RR-ENL比较中表现出相反的效应，表现为在RR中高表达而在ENL中低表达的前几位基因（C2CD4B， CEMIP， IL23A， CD7， GPC5， EBF1， SIGLEC15， ADAT2， ZC3H12D）。此外，IPA分析显示，在RR中，Sm29对CSF2的调节增加了IL10，而对IFN-α的调节影响了CXCL9、CXCL-10、IL15、TLRs 2和4；另一方面，在ENL中，rSm29对IL1B和FN1基因的调节似乎与几种趋化因子和细胞因子如IL6、CCL2和CXCL8相关。结论：麻风病被证明是研究能够调节宿主炎症反应产物的有效模型。此处，研究人员为利用免疫生物制剂带来了新的见解，扩展了该领域的关注点，可能有助于麻风病患者，特别是反应性发作期间的管理。
麻风病是一种由麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）及次要病原体麻风分枝杆菌（Mycobacterium lepromatosis）引起的被忽视的传染病。该病主要影响皮肤，随后发展至继发阶段，引起可能长期致残的周围神经病变。1966年，Ridley和Jopling根据患者免疫应答的差异，从自愈到五种光谱临床形式（结核样型、界线结核样型、界线-界线型、界线-瘤型、瘤型）对麻风病进行了分类。此外，约30-40%的麻风病患者被诊断为急性炎症反应：1型反应或逆转反应（RR）由针对M. leprae抗原的细胞免疫加剧介导，临床表现为神经炎和/或皮肤病变的炎症和红斑；2型或麻风结节性红斑（ENL）形式包括中间型单核细胞和其他免疫细胞的激活、多个组织中的免疫复合物以及高水平的肿瘤坏死因子（TNF）产生，表现为皮下结节的突然出现，以及发热、关节炎、肌痛、神经炎等全身性临床表现，可能需要住院治疗。世界卫生组织（WHO）推荐使用皮质类固醇治疗RR，使用沙利度胺治疗ENL，但这些都是公认具有副作用且会增加发病率的治疗资源。
曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）感染或相关产物可以下调自身免疫疾病特征性的1型CD4+ T细胞炎症应答。Sm29是一种位于成虫和肺期童虫体被膜上的膜结合糖蛋白。重组Sm29蛋白（rSm29）已被证明是一种在人类T淋巴细胞病毒1型（HTLV-1）引起的脊髓病（HAM/TSP）和巴西利什曼原虫（Leishmania braziliensis）引起的皮肤利什曼病（CL）等感染性炎症疾病中具有免疫调节能力的分子。初步数据表明，在体外，重组Sm29减少了超过60%的CL患者单核细胞中干扰素-γ（IFN-γ）和TNF的产生，从而确定了Sm29在调节Th1型免疫应答方面的免疫调节潜力。遵循同一思路，重组Sm29也在HTLV-I患者的细胞培养中进行了测试。当向PBMC培养物中添加rSm29时，来自其中50%患者的细胞IFN-γ产生减少。在这两种疾病中，免疫调节效应与Sm29诱导的白细胞介素-10（IL-10）水平升高有关。
另一方面，越来越多的证据表明，慢性蠕虫感染，特别是血吸虫属（Schistosoma sp）或寄生虫产物，可以调节基于过敏的疾病（如哮喘）中的2型炎症反应。最近，在一项针对CL患者的临床试验中，使用了rSm29纳米制剂作为佐剂局部联合锑葡胺（MA）治疗该病。MA + rSm29的使用导致了更高的愈合率（71%），而单独使用MA的愈合率为43%，并且在接受MA + rSm29的受试者中，病变愈合时间显著缩短。
目前尚无关于Sm29抗原对麻风病患者细胞影响的数据。这项开创性研究深入探究了麻风病患者PBMCs的转录组谱，包括经历麻风反应的患者，通过在用重组Sm29抗原刺激后进行RNA测序（RNA-sequencing）分析。利用高通量测序，该研究旨在揭示rSm29调节麻风病免疫应答的分子机制。
本研究的样本来源于巴西安联医院（Hospital Universitario Edgard Santos）和库托马亚研究所（Couto Maia Institute）的麻风病参考治疗中心。研究人员选取了12名患者，其中4名无反应（WR），4名RR，4名ENL，基于Ridley-Jopling标准进行诊断，并结合临床皮肤神经学评估以及组织病理学和杆菌指数数据。
研究人员从30毫升肝素化血液中获取PBMCs，使用Ficoll Hypaque? Plus密度梯度离心，并将细胞调整至浓度为3 x 10^6细胞/毫升，置于RPMI 1640培养基中，添加10%灭活AB+人血清、庆大霉素（100 U/ml）、L-谷氨酰胺（2mM）和HEPES（25mM）。培养物在37°C和5% CO2条件下用以下三种刺激物培养12和18小时：1-培养基；2- M. leprae超声抗原（ML）（20 μg/mL）；3- rSm29（10 μg/mL）。在含有rSm29的细胞培养物中，孵育期间加入了15μl多粘菌素B以消除可能的脂多糖（LPS）效应。
RNA提取采用miRNeasy? Mini Kit（Qiagen）。RNA文库构建使用TruSeq Stranded Total RNA Prep Globin kit（Illumina）。测序在Nextseq 2000（Illumina）上进行，配对末端2x100 bp读长。原始测序数据存入NCBI序列读档库（SRA），BioProject登录号PRJNA1463881。生物信息学分析使用FastQC、Trimmomatic、STAR、featureCounts、DESeq2等工具进行质量控制、比对和差异表达分析。功能富集分析采用IPA软件（QIAGEN Inc.）。免疫细胞组成推断使用CIBERSORTx工具，以LM22作为特征矩阵。
研究首先分析了不同反应状态下麻风病患者的细胞因子和趋化因子谱。通过ELISA技术检测血清水平，发现与抗原刺激（M. leprae或rSm29）相比，TNF、IL-6和IL-10在反应性组（REAC，包括RR和ENL）和WR组中显著升高。特别值得注意的是，IL-6水平在M. leprae和rSm29刺激下相较于未刺激的培养基显著升高，提示在逆转反应中存在增强的抗原驱动炎症反应。
转录组学比较显示，主成分分析（PCA）能够将rSm29刺激的样本与WR和RR组中的其他样本分开，而在ENL组中分离更细微。差异基因表达分析揭示，与M. leprae刺激相比，rSm29刺激在RR组中诱导了230个上调和1352个下调的DEGs；在ENL组中诱导了496个上调和270个下调的DEGs；在WR组中诱导了82个上调和585个下调的DEGs。值得注意的是，在RR组中对rSm29刺激响应最强烈的高表达基因（如C2CD4B， CEMIP， IL23A），在ENL组中却相反地属于低表达基因之列，这突出了两种反应形式对rSm29的不同调节模式。
IPA分析进一步揭示了在rSm29刺激下，不同临床形式独特的转录和通路调节特征。在RR和WR组中，rSm29刺激诱导了类似模式的负向调节，涉及细胞运动、迁移、侵袭、吞噬以及细胞骨架和细胞质组织等生物功能。RR组表现出最显著的下调，突出了rSm29在该临床形式中独特的免疫调节作用。在经典通路（CP）分析中，rSm29在RR和WR组中导致了关键免疫和炎症通路（如中性粒细胞脱颗粒、吞噬体形成、I类MHC介导的抗原加工提呈以及神经炎症信号通路）的负向调节，RR组再次表现出最显著的下调。
在RR组中，rSm29 vs M. leprae的比较中识别出两个关键的调控网络。第一个网络以CSF2为中心上游调节因子，预测其负向调节先天免疫受体（TLR2， TLR4）和粘附分子（ICAM1），同时促进IL-10和PTGS2的表达。第二个网络以IFN-α为中心，协调促炎转录负向反应，包括模式识别受体（TLR2， TLR4）和关键免疫介质如CXCL9、CXCL10和IL15。在ENL中，调控网络分析则突出了FN1和IL1B作为负调节的上游调节因子，调节一系列促炎趋化因子（如CCL2， CCL4， CXCL1， CXCL3， CXCL5， CXCL8）以及细胞因子IL1B和IL-6，这些分子与中性粒细胞募集和急性炎症反应扩大有关。
通过比较不同刺激下的基因集，研究人员在rSm29刺激下发现了一组在RR和WR之间共享的235个基因的转录特征。功能富集分析显示，大多数富集过程呈负向调节，包括细胞迁移、微管动力学和整体细胞运动。经典通路分析揭示了中性粒细胞脱颗粒、类风湿关节炎中破骨细胞作用、IL-15和IL-10信号通路等的负向调节。此外，还识别出RR/WR特有的143个基因的转录特征，涉及凋亡、内吞作用、T淋巴细胞增殖以及NF-κB信号通路等的负向调节。ENL组则拥有一个独特的23个基因的转录模块，与血管生成、细胞迁移和侵袭的负向调节有关。上游调节因子（UTR）分析显示，在RR组中rSm29刺激导致关键促炎调节因子（如IFNG， TNF， STAT1， CSF2）的强烈预测抑制，表明rSm29的抗炎作用；而在WR组中，rSm29刺激则表现出上游调节因子的正向调节谱，提示更偏向促炎的应答。
免疫细胞组成反卷积分析显示，rSm29刺激在WR组中导致活化肥大细胞显著富集（p ≤ 0.01），而单核细胞和M0巨噬细胞比例降低。在RR组中，变化更为显著且具有细胞类型特异性：单核细胞比例在培养基中最高，在rSm29刺激下降低；而活化肥大细胞在rSm29刺激下占主导。M0巨噬细胞在培养基和M. leprae刺激下比例较高。活化树突状细胞在不同刺激下变化显著。ENL组的模式与RR相似，单核细胞比例在rSm29刺激下显著降低，活化肥大细胞和初始B细胞比例则升高。
讨论部分整合了多层数据。ELISA结果显示的细胞因子/趋化因子谱，尤其是反应性患者中TNF、IL-6的增加和IL-10的诱导，在转录组层面得到了印证，特别是在RR组中IL-10基因的上调。这表明rSm29具有诱导调节性反应的潜力，但后续的转录后机制也影响了其产生。转录组分析揭示了rSm29施加了一个连贯的、上下文依赖的免疫调节程序：它普遍削弱了先天性、巨噬细胞中心（Th1）特征，同时增强了2型/体液免疫特征（如活化肥大细胞、嗜酸性粒细胞和初始B细胞的富集），这种效应大小取决于基线炎症状态。
多层数据表明，rSm29在蛋白和推断的细胞类型水平上使反应偏离巨噬细胞中心的Th1生物学，但其诱发的转录反应在RR与ENL之间存在质的不同。在RR（以强烈的Th1/IFN驱动的细胞反应为特征）中，rSm29揭示并放大了一个具有调节成分的淋巴样模块；而在ENL（以全身性炎症为特征）中，该淋巴样/调节模块未被激活或被抑制，取而代之的是趋化通路。这与经典描述相符，表明RR与ENL之间存在质的差异。
研究还识别出在rSm29刺激下，RR/WR组特有的143个基因签名和ENL组特有的23个基因模块，凸显了反应形式间的异质性。在RR中，与炎症细胞激活相关的通路（如类风湿关节炎相关机制）显著下调。CSF2和IFN-α作为上游调节因子，影响IL-10等关键基因，可能具有重要的生物学意义。这些通路涉及中性粒细胞脱颗粒、吞噬体形成、S100家族信号通路以及神经炎症信号通路等，这些都与麻风病的免疫病理学密切相关。
目前麻风反应的管理主要依赖皮质类固醇和沙利度胺，但这些药物具有显著的副作用。新发现的rSm29能够调节关键炎症通路，提示靶向这些通路可能成为开发新的、毒性较低的治疗策略的基础，特别是在ENL中，过量的TNF产生是病理学的核心驱动因素。本研究使用无反应患者作为参考组提供了有意义的临床基线，但样本量较小（每组n=4），结果应视为探索性的，需要在更大、更多样化的队列中进行验证。
综上所述，本研究证明了rSm29能够在麻风病的不同临床形式中触发不同的、上下文依赖的转录组反应。对免疫通路的复杂调节突显了rSm29作为开发新型、毒性较低治疗策略基础的潜力。
本研究证实了rSm29能够调节麻风病反应的强烈炎症过程，识别出了一种可能推进特定临床状况治疗研究的免疫生物制剂。该领域的知识进步对于预防残疾和减少与当前疗法使用相关的发病率具有重要意义，特别是在难治性病例中。
