《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Salivary exosomal Mycobacterium tuberculosis DNA enables sensitive detection of paucibacillary tuberculosis: a molecular diagnosis study
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背景：非痰液检测工具是当前结核病诊断策略的重要补充。本研究旨在确定双基因qPCR熔解曲线检测法能否通过分析唾液外泌体中的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）DNA来诊断少菌型结核病。方法：研究人员开发了一种基于外泌体核
背景：非痰液检测工具是当前结核病诊断策略的重要补充。本研究旨在确定双基因qPCR熔解曲线检测法能否通过分析唾液外泌体中的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）DNA来诊断少菌型结核病。方法：研究人员开发了一种基于外泌体核酸（Exosomal nucleic acid, ExoNA）的唾液结核诊断方法，该方法整合了唾液外泌体富集、核酸提取和双靶向qPCR熔解曲线分析（Dual-gene qPCR melting curve analysis, DGPMC），是一种快速、非痰液的结核病诊断方法。在一项先导性临床研究中，招募了疑似肺结核（Pulmonary tuberculosis, PTB）的成人患者，以多种参考标准评估其诊断性能。针对抗酸染色涂片阴性的患者进行了亚组分析。结果：唾液外泌体DNA被确定为唾液中可检测到的Mtb DNA的主要形式。基于ExoNA的唾液结核诊断将周转时间从16小时缩短至3小时，检测限达到10 CFU/mL。研究共纳入130例疑似PTB患者。其中，36·9%（48/130）为无症状者，80·8%（105/130）的患者痰涂片镜检结果为阴性。基于微生物学参考标准（n=45），基于ExoNA的唾液结核检测（ExoNA-based Saliva TB assay）的敏感性为81.2%（95% CI 53.7%-95.0%），特异性为82.8%（95% CI 63.5%-93.5%）；在扩展微生物学参考标准（n=98）下，敏感性为68.4%（95% CI 54.6%-79.7%），特异性为82.9%（95% CI 67.4%-92.3%）。在105例涂片阴性患者的亚组中，不同参考标准下的敏感性范围为67.5%至75.0%，特异性范围为82.1%至82.9%。结论：基于ExoNA的唾液结核检测在疑似PTB患者中显示出良好的诊断性能，具有无创、采样简便、检测快速的优势。在应用于临床之前，有必要在更多样化的人群中进行多中心验证。
本研究的背景源于全球结核病（Tuberculosis, TB）防控中持续存在的病例发现缺口。世界卫生组织（WHO）2025年的数据显示，全球估计有1070万结核病患者，但仅有830万例被报告。诊断能力不足限制了患者发现，导致结核病在人际间传播。WHO推荐使用如GeneXpert MTB/RIF（Xpert）等快速分子检测进行结核病的初始诊断，以实现及时治疗。然而，这些检测方法在采集少菌型结核病（Paucibacillary TB）患者的样本时面临挑战。少菌型结核病被定义为呼吸道标本抗酸杆菌（AFB）涂片阴性的肺结核，这类患者常需采用侵入性方法获取有效标本，可能影响患者依从性。因此，WHO提出考虑使用非痰液样本进行诊断的替代策略。
外泌体是细胞分泌到细胞外基质中的囊泡样结构，可包裹并运输蛋白质、脂质和核酸等多种生物载荷。鉴于其在体液中丰度高、稳定性好且富集亲本细胞信息，外泌体被视为一种有前景的诊断标志物。唾液易于采集，富含外泌体，且其基质生物复杂性较低，有利于开发简化的基于外泌体的检测方法。本研究旨在开发并验证一种精简的方法，该方法整合了高效的ExoNA富集与高灵敏度的qPCR检测，以检测唾液中的Mtb DNA。
研究人员开展了一项前瞻性诊断准确性研究，评估基于ExoNA的唾液结核诊断方法的临床性能。研究队列来自2023年4月1日至9月30日在上海肺科医院招募的疑似PTB患者。入组标准为年龄大于15岁、HIV检测阴性、入院前痰涂片阴性或无症状。通过一系列临床和实验室检查，包括症状评估、QuantiFERON-TB（QFT）血液检测、高分辨率胸部CT扫描、分枝杆菌涂片和培养以及支气管镜检查，对患者进行基线评估。同时采集了每位患者的唾液样本，并使用开发的ExoNA试剂盒进行外泌体富集、核酸提取和双基因qPCR熔解曲线分析。研究采用了四种诊断参考标准：微生物学参考标准（Microbiological Reference Standard, MRS）、扩展微生物学参考标准（extended MRS, eMRS）、排除临床结核标准和临床结核标准。所有研究方法均按照标准操作程序进行，以确保结果的可靠性。
研究得出了多项重要结论。首先，ExoNA方法在性能上与商业化的ExoQuick试剂盒相当，但周转时间大大缩短（<1小时对比>16小时），且能获得高纯度DNA（OD260/OD280 > 1.8）。全分析流程（包括外泌体纯化、DNA纯化和qPCR分析）仅需约3小时。通过对唾液组分（上清液、沉淀物和全唾液）的分析，证实唾液中可检测到的Mtb DNA主要来源于上清液中的外泌体，这一发现支持了外泌体介导的靶标富集效应可能提高了检测灵敏度。
在先导性诊断准确性试验中，共分析了130例疑似PTB患者。结果显示，基于ExoNA的唾液结核检测方法在不同的微生物学参考标准下均表现出有前景的诊断性能。具体而言，在排除临床结核标准下，敏感性为81·2%，特异性为90·0%；在MRS下，敏感性为81·2%，特异性为82·8%；在eMRS下，敏感性为68·4%，特异性为82·9%。在105例涂片阴性患者的亚组分析中，该方法的诊断性能依然稳健，在MRS下的敏感性为75·0%，特异性为82·1%，在eMRS下的敏感性为67·5%，特异性为82·9%。这表明该方法在传统方法（如涂片镜检）难以检测的少菌型结核病患者中具有潜在的辅助诊断价值。
讨论部分指出，本研究开发的基于双基因qPCR的ExoNA检测法在结核病诊断中表现良好。其性能与已验证的非痰液诊断方法（如尿液脂阿拉伯甘露聚糖检测）相当甚至更优，尤其是在微生物学标准下的敏感性。尽管在排除临床结核标准下的特异性略低于WHO对非痰液检测的要求，但这可能源于研究人群的特殊性——大部分为低菌载量、症状轻微的患者，传统的培养或Xpert检测可能出现假阴性，而ExoNA则可能检测到这些病例，从而表现为“假阳性”。亚组分析显示，该方法在涂片阴性患者中表现稳健，其优势在于专门富集了与疾病相关的唾液外泌体，而非仅检测口咽部脱落的Mtb核酸。研究还发现部分潜伏性结核感染（Latent TB infection, LTBI）患者可能因方法灵敏度高而出现阳性结果。本研究的主要局限性在于为单中心研究，且特异性尚需在更广泛人群中进一步验证。
研究结论部分指出，在疑似PTB患者中，ExoNA检测对结核病显示出良好的敏感性和特异性。鉴于其操作简便、无创、可重复采样、灵敏度和特异性令人满意以及检测时间短等优势，ExoNA可能为传统结核病检测方法提供良好的补充，尤其是在检测低菌载量、无症状或症状轻微的疑似结核病患者时。为验证其稳健性，在临床应用之前，有必要在更多样化的人群中进行多中心研究。
