基于宏基因组二代测序技术揭示多种临床标本中真菌病原体谱的大规模回顾性分析

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：A large-scale retrospective analysis reveals the fungal pathogen spectrum across diverse clinical specimens using metagenomic next-generation sequencing

引言：侵袭性真菌病（Invasive Fungal Disease， IFD）的早期诊断仍是主要临床挑战，原因在于病原体的多样性及临床症状的非特异性。本研究采用宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing， mNGS）技术，全面分析了多种临床标本中的真菌分布谱及患者人群（性别和年龄）的人口学特征。研究结果为真菌感染的诊断与治疗提供了实验室依据。方法：本研究回顾性分析了2022年3月至2024年8月在武汉大学人民医院收集的11,161份临床标本的mNGS报告。综合剖析并比较了不同标本类型间的真菌谱和患者人口学特征。结果：真菌检出率最高的标本是支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）（36.85%， 1,985/5,387），其次是尿液（22.76%， 264/1,160）、血液（13.38%， 380/2,840）、胸腹水（12.91%， 174/1,348）、脑脊液（cerebrospinal fluid， CSF）（13.82%， 17/123）和伤口渗出液（12.87%， 39/303）。除CSF外，念珠菌属（Candida spp.）在所有标本类型中检出频率最高，而CSF中曲霉菌属（Aspergillus spp.）占主导。总体真菌检出率在男性患者中显著高于女性患者（26.76% vs. 23.84%， P?60岁个体中显著高于≤60岁个体（33.04% vs. 20.02%， P?侵袭性真菌病（IFD）是指由真菌侵入人体组织或血液引发炎症反应并导致器官功能障碍的一类感染性疾病。由于真菌病原体的多样性、临床表现常非特异且隐匿，以及缺乏特异性诊断标志，IFD的临床诊断和管理仍面临巨大挑战。全球疾病负担研究提示，IFD已成为日益严峻的公共卫生威胁。一项研究估计，全球每年有超过650万人受到威胁生命的真菌疾病影响，导致超过370万人死亡，其中约250万人直接归因于这些感染（Denning， 2024）。早期准确诊断对于启动适当治疗和改善患者预后至关重要（Sedik et al.， 2024）。传统上，IFD的诊断依赖于临床表现及辅助性实验室或影像学检查。然而，临床表现的非特异性常导致诊断延迟。辅助诊断方法包括影像学研究、真菌培养以及基于非培养的技术，如血清学和免疫学检测，例如1,3-β-D-葡聚糖试验（G试验）、半乳甘露聚糖检测（GM试验）及抗原/抗体检测，但每种方法都有其局限性，如灵敏度低、周转时间长以及因先前抗真菌治疗导致的假阴性结果的可能性（Formanek and Dilling， 2019; Fang et al.， 2023; Zhu et al.， 2023）。因此，开发快速准确的诊断技术对于实现IFD患者的早期干预和改善临床结局至关重要（Kozel and Wickes， 2014）。近年来，分子生物学的进步革新了IFD的诊断。宏基因组二代测序（mNGS）凭借其优越的诊断灵敏度和特异性（Yang et al.， 2022a），能够快速、客观地检测所有已知基因序列的病原体。该技术非常适合于培养或血清学检测等常规方法难以诊断的病例（Chiu and Miller， 2019）。此外，mNGS无需靶向扩增，并可测序耐药基因，从而为指导临床调整治疗方案提供关键见解（Han et al.， 2019）。总体而言，mNGS技术显著提高了病因学诊断的准确性和及时性，为临床医生的临床决策提供了关键证据。研究人员此前对通过mNGS检测到真菌的BALF患者进行分析时发现，仅12.9%的真菌阳性病例在抗真菌治疗后得到改善（Liu et al.， 2024），这一观察结果凸显了首先需要在不同标本类型和人群中更广泛地表征真菌检测全貌的必要性。然而，目前鲜有研究系统地使用mNGS来全面描述跨越多种临床标本的完整真菌病原体谱。考虑到以往研究的局限性，本研究旨在表征通过mNGS在不同标本类型和患者群体中检测到的真菌谱，检验检测模式是否因标本类型而异，老年男性是否具有更高的风险，以及呼吸道样本中细菌-真菌共检测是否常见。研究结果可能为支持临床医生诊断提供有力证据。本研究为单中心、回顾性描述性研究，数据来源于2022年3月1日至2024年8月31日在武汉大学人民医院接受mNGS检测的临床标本。所有入组样本均来自临床疑似感染、常规微生物学检测阴性或经验性抗感染治疗失败且符合mNGS检测临床指征的患者。排除报告不完整和/或临床信息不全的标本。最终纳入11,161份样本，涵盖六种不同标本类型：支气管肺泡灌洗液（BALF， n = 5,387）、尿液（n = 1,160）、血液（n = 2,840）、胸腹水（n = 1,348）、伤口渗出液（n = 303）和脑脊液（CSF， n = 123）。收集了患者的年龄、性别、报告日期、科室、临床诊断、标本类型和mNGS报告详情等数据。研究方案经武汉大学人民医院伦理委员会批准（WDRM2025-K198）。研究使用的关键技术方法包括：宏基因组二代测序（mNGS）技术，用于从临床标本中无偏倚地检测真菌、细菌等病原体的核酸序列；DNA提取与文库构建，使用特定试剂盒和流程处理标本；高通量测序平台（如Nanopore MinION）进行测序；以及生物信息学分析，将测序数据与参考数据库进行比对以鉴定病原体。数据来源于武汉大学人民医院的单中心回顾性队列。基于对11,161份标本mNGS结果的回顾性分析，本研究系统阐述了不同临床标本中真菌病原体的分布特征。结果显示，在所有标本类型中，念珠菌属（Candida spp.）和曲霉菌属（Aspergillus spp.）占据主导地位，两者共同占所有鉴定的72.80%。BALF和尿液标本的真菌检出率显著高于其他通常为无菌的标本（如血液、CSF）。男性患者和年龄超过60岁的个体表现出更高的真菌检出率，尽管这种趋势因标本类型而异；多变量分析进一步证实，男性性别（aOR = 0.893）和高龄（≥80岁：aOR = 14.77）是真菌检出的独立危险因素。约70%的真菌阳性标本中同时检测到细菌序列，而近16%的标本呈两种或以上真菌阳性。该研究结果揭示了念珠菌和曲霉菌的普遍性，识别了老年男性为高危人群，并强调了细菌-真菌共检测的高频率。这些发现有助于IFD的早期诊断和精准治疗，指导合理的抗真菌药物使用，优化治疗策略，并为有效控制感染、改善患者预后及降低死亡率奠定了坚实的科学基础。因此，本研究具有重要的临床价值和转化意义。研究结果表明，念珠菌和曲霉菌是各标本类型中最常检测到的真菌，共占所有鉴定的72.80%。近期研究已证实，在免疫功能低下宿主中，由这两个属引起的感染是IFD的主要组成部分，并显著导致发病率和死亡率增加（Giannella et al.， 2025; Chowdhary et al.， 2023），这与本研究结果一致。尽管念珠菌种在大多数标本类型中占优势，但CSF标本中曲霉菌种的检出频率高于念珠菌。肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii）仅在BALF标本中被识别，这与其作为免疫功能低下宿主肺孢子菌肺炎主要病原体且较少发生肺外播散的既定角色相符（Lagrou et al.， 2021）。相比之下，尽管隐球菌属（Cryptococcus spp.）最常影响中枢神经系统和肺（Chang et al.， 2024），但本研究CSF标本中仅检测到一例，这可能反映了样本来源的区域流行病学特征。关于罕见真菌，研究人员在BALF、尿液和伤口渗出液标本中检测到16例毛霉目（Mucorales）真菌，并在BALF和腹水标本中检测到6例马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei）。这些真菌通常仅影响特定的免疫功能低下个体，如艾滋病患者（Steinbrink and Miceli， 2021; Wang et al.， 2023）。这些罕见真菌的检出突显了mNGS在诊断罕见真菌感染方面的价值。IFD在很大程度上是一种“机会性感染”，其发生与宿主免疫状态密切相关。面临机会性真菌感染风险的人群包括器官移植受者、需要干细胞移植的血液系统疾病患者（Elhaj Mahmoud et al.， 2024）、艾滋病/获得性免疫缺陷综合征（HIV/AIDS）或糖尿病患者，以及接受长期免疫抑制治疗者（Fang et al.， 2023）。研究数据显示，尽管不同科室的真菌属分布模式存在差异，但总体检出主要集中在照护免疫功能低下人群的单位，如重症监护科、老年病科、肿瘤科和器官移植科。由于送检标本量大以及肺部真菌定植等因素，呼吸内科仍然是真菌阳性标本的主要来源。总体而言，男性患者标本中的真菌检出率高于女性患者。Egger等人（2022）报告，除侵袭性念珠菌病外，几乎所有真菌疾病的发病率在男性中均较高，这与本研究发现一致。多变量Logistic回归分析证实，男性性别是真菌检出的独立危险因素，在调整年龄、标本类型和科室后，女性真菌检出的比值约比男性低10.7%（aOR = 0.893， 95% CI： 0.824-0.967， P?=?0.006）。在男性患者的BALF和伤口渗出液标本中观察到更高的真菌检出率，这与总体趋势一致。有趣的是，女性患者尿液标本中的检出率更高，这与解剖和生理因素密切相关，如女性尿道较短且直、靠近生殖道以及激素水平等（Timm et al.， 2025; Yang et al.， 2022b; Foxman， 2014; Neugent et al.， 2022）。这一发现提示，对于尿液反复检出真菌的女性患者，临床医生不仅应关注抗真菌治疗，还应注意泌尿生殖道菌群的恢复和排尿习惯。此外，在解读女性尿液标本的mNGS报告时，临床医生应意识到定植的可能性更高，以避免过度治疗。不同真菌属的检出率在性别间未观察到显著差异。值得注意的是，由于本研究仅收集了真菌检出的数据而非确诊感染，目前尚不清楚真菌实际感染率是否存在性别相关差异。侵袭性真菌感染已成为老年人群中日益严重的问题，机会性真菌感染的发病率不断上升（Kauffman， 2001）。部分原因是老年患者更有可能接受实体器官或骨髓移植、接受恶性肿瘤的强化治疗，并为合并症服用免疫抑制药物（Baddley et al.， 2011）。此外，老年患者更易受到侵袭性地方性或机会性感染的影响，且预后往往更差（Kauffman， 2001）。总体而言，本研究中老年人群标本的真菌检出率高于非老年人群，这与先前研究结果一致。值得注意的是，多变量分析揭示了风险随年龄增长的显著梯度：与未成年人（<18岁）相比，年轻人（18-39岁）的校正检出风险增至7.6倍，中年人（40-59岁）为8.4倍，老年人（60-79岁）为10.3倍，而高龄老人（≥80岁）则达到近14.8倍（所有P < 0.001）。这种剂量-反应关系强有力地支持了年龄是驱动真菌检出的主要因素。然而，进一步分析显示，并非所有标本类型都表现出与总体趋势一致的年龄分布模式；BALF和胸腹水标本在老年人群中的检出率更高。此外，在检出的真菌属中，仅念珠菌属在老年人群中的检出率较高，而其他真菌属未表现出年龄相关偏好。BALF和尿液标本的真菌检出率最高。此外，多真菌检出在BALF标本中更为常见。这些差异可能归因于呼吸系统和泌尿系统解剖结构的差异、真菌定植特性以及用于标本采集的临床操作不同（Zinter et al.， 2019; Gu et al.， 2019; Langelier et al.， 2018）。这突显了mNGS的一个局限性，即无法区分定植与感染。因此，mNGS结果应结合临床表现、其他诊断发现和流行病学背景，并与无模板对照进行综合解释（Simner et al.， 2018）。相比之下，在血液、CSF和胸腹水等通常为无菌部位检测到病原体强烈提示为真正感染。尽管单真菌检出在所有标本类型中占主导，且CSF标本中未观察到多真菌检出病例，但真菌的共检测仍然是临床需要关注的问题。Wang等人（2019）报告，mNGS在诊断混合肺部感染方面比传统方法表现出显著更高的灵敏度，但代价是特异性较低。在本研究中，近70%的真菌阳性临床标本表现出病原体共检测。在BALF、尿液和血液标本中，细菌-真菌共检测率约为70%，而在三个样本量较小的标本类型中，共检测率升至80%。尽管mNGS报告的解读需要综合考虑多种因素，且细菌-真菌共检测不一定意味着真正的共感染，但一些临床见解值得关注。真菌感染常发生在免疫功能低下个体中，而免疫抑制是细菌-真菌共感染的已知危险因素（Zhou et al.， 2020）。此外，已证实抗生素暴露可促进真菌过度生长（Jain et al.， 2021），且细菌-真菌共感染的临床表现往往比单纯真菌感染更严重。因此，在临床实践中，对于疑似细菌和真菌感染的患者，应系统评估其是否为共感染，以促进更精准的抗真菌治疗策略的制定。本研究存在一些局限性。首先，由于回顾性设计，缺乏与常规微生物学方法（培养、血清学）和临床数据（影像学、治疗反应、死亡率）的直接比较，无法评估mNGS的诊断性能和临床应用价值。因此，研究结果反映的是“真菌检测谱”而非“真实感染谱”，在将结果外推至临床诊断时需谨慎。其次，作为单中心回顾性研究，其结果的普适性可能固有地受限。第三，mNGS技术存在固有的技术偏差，包括DNA提取效率、PCR扩增偏好性和数据库覆盖范围的差异，这可能影响不同真菌类群的相对检测频率。基于本研究，未来研究应：（1）前瞻性地将mNGS与完整临床数据整合，以区分感染与定植；（2）扩展到多中心队列以验证普适性和区域差异；（3）比较mNGS指导与经验性治疗在临床效用和成本效益方面的差异。通过对11,161份临床标本mNGS结果的回顾性分析，本研究系统地描述了真菌病原体的分布特征。研究发现：（1）念珠菌和曲霉菌种在所有标本类型中占主导地位；（2）与其他通常无菌的标本相比，BALF和尿液标本的真菌阳性检出率显著更高；（3）在男性患者和年龄超过60岁的个体中观察到更高的真菌检出率，尽管这些趋势具有标本类型依赖性；多变量分析进一步证实，男性性别（aOR = 0.893）和高龄（≥80岁：aOR = 14.77）是真菌检出的独立危险因素；（4）约70%的真菌阳性标本表现出细菌序列共检出，而近16%的标本呈两种或以上真菌阳性。本研究为理解不同临床标本中的真菌检测谱提供了详细数据，并为临床实践中解读mNGS报告时识别高危人群和混合感染风险提供了流行病学参考点。总之，临床医生应将mNGS结果与标本类型（标本来源是否为无菌部位）、宿主因素（包括性别、年龄和免疫状态）、影像学发现、常规真菌学检测（G/GM试验、培养）以及患者的临床表现相结合，以准确区分定植与感染，从而指导精准抗真菌治疗。