CD4/CD8比值与HIV感染者疫苗诱导免疫应答的结构重组相关

《Frontiers in Immunology》：CD4/CD8 ratio is associated with structural reorganization of vaccine-induced immune responses in people living with HIV

　　

尽管接受了有效的抗逆转录病毒治疗（ART）并实现了持续的病毒抑制，HIV感染者（PLWH）仍表现出持续的免疫激活和低度炎症。^CD4/^CD8比值作为免疫健康标志物受到常规监测，但残余免疫失调的潜在机制仍不完全清楚。研究人员收集了HIV感染者和健康对照（HC）在接种两剂mRNA疫苗前及一个月后的外周血单个核细胞（PBMCs），并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合配对的T细胞受体（TCR）分析进行检测。进行了差异基因表达（DGE）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，并比较了各组间的节点度分布。对TCR和整体B细胞受体（BCR）库进行了分析，并评估了中和抗体反应。HIV感染者按^CD4/^CD8比值进行分层。^CD4/^CD8比值分层揭示了HIV感染者中不同的免疫状态。正常^CD4/^CD8比值组的差异基因显示出集中的转录激活和协调的趋化因子相关通信，而低^CD4/^CD8比值组则表现出广泛的转录失调和基因表达网络的结构重组。该网络特征的特点是PPI拓扑结构改变以及单核细胞特异性节点度显著增加，且独立于整体转录复杂性。库分析显示低^CD4/^CD8比值组存在克隆偏倚和克隆型多样性降低，这与免疫协调受损一致。结论是，HIV感染者中疫苗诱导的免疫应答受到与^CD4/^CD8比值定义的免疫状态相关的网络级组织的影响。低^CD4/^CD8比值组显示出增加的单核细胞特异性PPI连接性和克隆失衡，这表明存在传统的临床标志物无法捕捉到的疫苗诱导反应动力学改变。

本研究旨在阐明HIV感染者（PLWH）在实现病毒抑制后仍然存在的免疫失调机制，特别是^CD4/^CD8比值这一常规临床指标如何影响其对疫苗的免疫应答。研究背景在于，尽管ART有效，PLWH仍面临持续免疫激活、炎症和非AIDS相关合并症风险增加的问题。^CD4/^CD8比值虽被广泛用于评估免疫恢复，但其对免疫失调的细胞和分子组织机制解释有限。COVID-19 mRNA疫苗的广泛接种为研究这一问题提供了契机，因为PLWH的疫苗应答差异大，且受基线免疫状态影响，而保护性免疫不仅取决于抗体滴度，更涉及复杂的细胞与体液免疫协调。现有研究多关注基因水平或组成变化，对更高阶的免疫网络结构表征不足。因此，研究人员通过整合单细胞转录组和免疫库分析，试图揭示超越传统临床标志物的系统性免疫状态，阐明基线免疫平衡如何塑造PLWH的疫苗反应。这项发表在《Frontiers in Immunology》的研究，对于理解免疫缺陷人群的疫苗应答机制和制定分层免疫策略具有重要意义。

为开展本研究，研究人员采用了几个关键技术方法。首先，对来自PLWH和健康对照（HC）在接种COVID-19 mRNA疫苗前后采集的外周血单个核细胞（PBMCs）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以高分辨率解析转录状态和细胞间通信。其次，结合了配对的TCR测序和整体BCR测序，以分析疫苗诱导后的T细胞和B细胞克隆动态与库多样性。此外，研究人员还构建并比较了基于差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，以评估基因表达网络的拓扑结构和中心性变化。研究队列包括8名接受稳定ART治疗的PLWH（其中4名^CD4/^CD8比值正常，4名比值降低）和2名HC。

研究结果部分首先对研究对象的特征进行了描述。参与者包括接受门诊治疗并维持稳定ART的8名PLWH和2名HC。根据基线^CD4/^CD8比值，PLWH被分为正常比值组（≥1）和低比值组（<1）。所有参与者均完成了两剂mRNA疫苗（BNT162b2或mRNA-1273）的接种。

**SARS-CoV-2中和抗体反应**。接种后，所有参与者均诱导产生了针对SARS-CoV-2武汉株的中和抗体，但滴度从HC到正常比值PLWH组，再到低比值PLWH组呈现下降趋势，尽管组间差异未达统计学显著性。这提示体液反应存在变异性，促使研究人员进一步从细胞和转录水平探究疫苗反应。

**研究组间的全局免疫细胞图景**。通过scRNA-seq分析了从8名PLWH和8名HC（包括2个本院样本和6个公共数据集）获得的总共约14万个PBMCs。利用Azimuth参考映射，在所有样本中一致注释了22个免疫细胞群。可视化分析显示，接种前后，HC和PLWH之间的主要免疫细胞簇大体保守，表明整体免疫细胞架构得以保留。然而，正常比值和低比值PLWH组在细胞组成模式上表现出差异，反映了基线免疫状态的不同。特别是，低^CD4/^CD8比值组在基线时以CD8⁺效应记忆T细胞（CD8 TEM）扩增和CD4⁺中央记忆T细胞（CD4 TCM）减少为特征，且在接种后CD14⁺单核细胞显著增加。

**PLWH免疫细胞中差异表达基因的变化**。为评估疫苗诱导的免疫反应，研究人员比较了各组内接种前后的基因表达谱。结果显示，HC组在接种后，CD4和CD8 T细胞、B细胞和单核细胞中部分基因的表达变化呈现协调性。相反，两个PLWH亚组中，这种跨细胞类型的协调性基因表达模式减弱，提示其转录反应异质性更高且更具细胞类型限制性。具体而言，低^CD4/^CD8比值组的CD8 T细胞和B细胞显示出较少的差异表达基因且以下调为主，而其单核细胞则表现出更广泛的转录变化，包括炎症和干扰素相关基因（如IL32、MX1、CCL3L1）的上调。

**蛋白质-蛋白质相互作用网络分析与可视化**。为研究疫苗诱导转录变化的组织方式，研究人员为每种免疫细胞类型和研究组构建了PPI网络。分析发现，在CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和B细胞中，源自HC的网络比源自PLWH的更大、连接更密集，提示PLWH淋巴细胞的转录反应协调性降低。然而，单核细胞网络呈现出不同的模式：特别是低^CD4/^CD8比值组的网络，其规模和连接性均高于对照组。

**节点度分布突出单核细胞特异性的网络中心性变化**。进一步分析节点度（衡量基因中心性的指标）发现，在PLWH的单核细胞特异性网络中，上调基因（红色节点）优先占据高度节点位置，表明疫苗诱导的基因被中心整合到相互作用网络中，而健康对照中未观察到此模式。统计检验显示，在PLWH的单核细胞中，上调基因的节点度显著高于下调基因，而在对照组中则无差异。此外，在PLWH中，节点度与转录上调呈正相关。对高度节点的检查显示，正常^CD4/^CD8比值组中，中心位置的上调基因包括IL1B、NFKB1和CXCL8等关键炎症介质；而低比值组的高度节点则富集了应激反应相关基因，特别是热休克蛋白（HSP）。基线分析表明，这些应激反应特征并非低比值组接种前独有的特征，而是在接种后出现。这些结果共同表明，在PLWH的单核细胞中，疫苗反应涉及网络结构的重组，诱导的基因占据中心调控位置。

**抗病毒通路富集和细胞间通讯在PLWH亚组间存在差异**。抗病毒通路富集分析显示，低^CD4/^CD8比值组在CD4 TEM/TCM细胞和CD14/CD16单核细胞中的富集程度强于正常比值组，表明不同免疫区室存在不同的抗病毒转录反应。细胞间通讯的配体-受体分析则揭示了亚组特异性的相互作用模式。趋化因子相互作用（如CCL3/CCL4/CCL5与CCR5/CCR4）在正常比值组中优先富集。而TNF相关信号通路则在亚组间不同：TNF-TNFR相互作用在正常比值组的CD4 TEM和MAIT细胞中增强；LTA-TNFR相互作用在低比值组的MAIT细胞中选择性增加；CD160-TNFR和BTLA-TNFR相互作用在低比值组的CD8 TEM、MAIT细胞和记忆B细胞中增加。这些模式表明亚组间接种后的通讯网络存在差异。

**PLWH接种后TCR库动态改变**。克隆扩增模式分析显示，HC在接种后无明显克隆扩增趋势，而PLWH在接种后，细胞毒性CD4 CTL和CD8 TEM区室中的扩增克隆显著增加。基线时，正常比值组的CD8 TEM细胞和低比值组的CD4 CTL细胞中已存在大克隆。接种后，两个PLWH亚组中CD8 TEM细胞的克隆扩增均变得显著。基于转录特征定义的TEMRA样细胞也显示出类似的扩增模式。利用公共抗原特异性数据库进行注释，发现SARS-CoV-2相关和CMV相关克隆型在各组中均存在，但并不能完全解释观察到的克隆偏倚模式，大多数克隆型无法匹配已知的抗原特异性。这些发现表明，PLWH中扩增的TCR库反映了广泛的抗原驱动或旁观者扩增，而非已知SARS-CoV-2特异性克隆的选择性放大，这可能受与HIV和CMV共感染相关的慢性免疫激活影响。

**接种后BCR库动态**。通过整体RNA测序分析B细胞克隆反应，发现了18,617个独特的BCR克隆型。接种后，同种型分布变化轻微且未达统计学显著性。与CoV-AbDab参考数据库比较显示，正常^CD4/^CD8比值组在接种后匹配已知SARS-CoV-2抗体的序列对数量有增加趋势，但未达显著性；低比值组则无显著变化。这些数据表明，保留^CD4/^CD8比值的PLWH中，疫苗相关BCR克隆型存在优先扩增的趋势，尽管这种效应在整体水平上较为温和。

本研究的讨论部分指出，尽管ART有效，PLWH对mRNA SARS-CoV-2疫苗的应答降低，尤其是在CD4计数较低时，这与持续的免疫激活和炎症相关。单细胞转录组分析揭示，PLWH的疫苗反应通过协调的免疫网络变化比通过一致的差异基因表达更能被捕获。网络组织的差异在单核细胞中最为显著。健康对照的疫苗反应网络相对紧凑且模块化，而低^CD4/^CD8比值PLWH的单核细胞来源PPI网络则扩展且连接更密集，基因中心性增加。鉴于单核细胞在塑造下游适应性免疫中的核心作用，这种扩展的网络架构可能影响T细胞启动和免疫记忆形成。细胞间通讯分析进一步支持了不同的细胞对话模式：正常比值组以趋化因子相关信号协调为主，低比值组则转向以TNF超家族相互作用为主的炎症调节回路。TCR库分析提供了低比值组免疫组织受限的额外证据，尽管存在克隆扩增，但SARS-CoV-2特异性克隆型并未显著富集，这可能受慢性免疫激活、初始T细胞可用性减少以及CMV等潜伏病毒特异性克隆扩增的影响。体液免疫也显示出质的差异：低比值组持续存在IgA优势且向SARS-CoV-2特异性BCR克隆型的汇聚减少，这与生发中心活性受损和功能性CD4 T细胞帮助减少一致。

论文的结论部分指出，^CD4/^CD8比值定义的免疫状态与PLWH中疫苗诱导协调的显著结构模式相关。疫苗反应性的改变并非孤立的转录变化，而是植根于免疫相互作用网络的重组、克隆动态和细胞间通信的改变。这些发现强调了超越传统临床标志物评估免疫组织的重要性，并为在免疫缺陷人群中考虑基线免疫状态的分层疫苗策略提供了理论依据。