去甲基雷公藤红素(Demethylzeylasteral, T-96)通过功能性调控MDM2–p21模块诱导鼠源及犬源乳腺肿瘤细胞G1期阻滞与线粒体凋亡

《Animal Diseases》：Demethylzeylasteral induces G1 arrest and mitochondrial apoptosis via functional modulation of the MDM2-p21 module in murine and canine mammary tumor cells

摘要：犬乳腺肿瘤(canine mammary tumors, CMTs)临床治疗难度大，且在分子与病理学特征上与人三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)高度相似。去甲基雷公藤红素(Demethylzeylasteral, T-96)具有显著抗肿瘤活性，但其作用于TNBC的机制尚不清楚，且BALB/c小鼠腹腔给药后的药代动力学(pharmacokinetics, PK)资料有限。本研究旨在探讨T-96对TNBC的治疗功效与潜在机制，并阐明其PK特征。转录组(transcriptomic)分析显示T-96调控细胞周期与凋亡相关通路；蛋白水平验证及MDM2扰动实验支持MDM2–p21信号模块(MDM2–p21 signaling module)参与T-96相关表型。分子水平上，T-96上调p21、BAX和cleaved caspase-9表达，下调MDM2和Bcl-2表达。PK分析表明T-96腹腔给药后达峰时间(Tmax)为2.0 h，半衰期(t1/2)为23.5 h。小鼠乳腺肿瘤模型中，T-96显著抑制TNBC生长，增加瘤中心坏死灶，减少肝肺转移。瞬转MDM2过表达及MDM2抑制剂共处理的功能验证支持MDM2对T-96部分表型的功能性贡献。据研究人员所知，本研究首次证实T-96处理与MDM2水平降低及p21表达升高相关，伴G1期富集和线粒体凋亡标志物激活，共同抑制TNBC细胞增殖；其中MDM2被鉴定为T-96关键功能介导因子而非直接分子靶标。研究结果表明MDM2–p21信号模块可部分功能性介导T-96相关的细胞周期阻滞与凋亡，为包括自发犬乳腺肿瘤模型在内的进一步评价提供了临床前比较肿瘤学(preclinical, comparative oncology–relevant)证据。

犬乳腺肿瘤(canine mammary tumors, CMTs)与人间三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)在分子与病理特征上高度相似，是极具价值的比较肿瘤学(comparative oncology)模型。TNBC占女性恶性肿瘤约15%，因缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(HER2)表达，化疗是目前主要全身治疗手段，但患者易出现原发或获得性耐药、高复发率及远处转移，亟需开发新型治疗策略。去甲基雷公藤红素(Demethylzeylasteral, T-96)系传统中药雷公藤(Tripterygium wilfordii)来源的三萜类化合物，较传统三萜毒性更低，既往研究显示其对肝细胞癌、黑色素瘤、胶质瘤及TNBC有一定抗瘤活性，可通过下调Smad信号抑制TGF-β诱导的侵袭、靶向ARF1抑制p-RB磷酸化、阻断PI3K/AKT/LSD1通路诱导凋亡，但T-96作用于TNBC的完整分子机制及其在BALB/c小鼠腹腔给药后的药代动力学(pharmacokinetics, PK)特征尚未明确。本研究以鼠源(4T1)、犬源(CMT-7364)及人源(MDA-MB-231)TNBC细胞为对象，结合转录组、蛋白检测、MDM2功能扰动、PK分析及体内成瘤实验，探讨T-96抗TNBC效果及MDM2–p21信号模块(MDM2–p21 signaling module)的介导作用，论文发表于《Animal Diseases》。

主要关键技术方法： 研究人员采用人TNBC细胞系MDA-MB-231、鼠TNBC细胞系4T1及犬TNBC细胞系CMT-7364（源自犬乳腺肿瘤组织，中国农业大学提供）；通过RNA高通量测序(RNA-seq)进行转录组差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)筛选与KEGG/GO富集分析，结合网络药理学预测核心靶点；采用CCK-8检测细胞活力、划痕(wound-healing)与Transwell评估迁移侵袭、克隆形成实验测长期增殖、免疫荧光测Ki-67；流式细胞术PI染色分析细胞周期、Annexin V-FITC/PI双染检测凋亡、透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察线粒体超微结构、TUNEL法测凋亡；Western blot检测MDM2、p21(CDKN1A)、p-RB、Cyclin B1、CDK2、Cyclin E1、BAX、Bcl-2、cleaved caspase-9、caspase-3；分子对接(molecular docking)与分子动力学模拟(molecular dynamics simulation)；细胞热位移实验(cellular thermal shift assay, CETSA)评估T-96与MDM2蛋白稳定性关系；瞬转pcDNA3.1(+)-MDM2过表达及MDM2抑制剂SP141共处理进行功能回补/协同验证；BALB/c小鼠腹腔注射T-96行PK检测（LC–MS/MS定量血药浓度）及4T1原位移植瘤模型评估体内抑瘤、转移抑制与安全性（H&E染色、血生化、免疫组化IHC）。

研究结果

T-96 can inhibit the growth, migration and invasion of TNBC cells in vitro

T-96以剂量依赖性方式抑制MDA-MB-231、CMT-7364及4T1细胞活力，IC₅₀分别为32.28 μM、32.99 μM和46.95 μM；延长给药时间抑制增殖效应增强；集落形成能力下降；划痕与Transwell实验显示剂量依赖性抑制迁移与侵袭；免疫荧光示Ki-67阳性细胞比例降低。结论：T-96在时间与浓度依赖模式下抑制TNBC细胞活力、迁移及侵袭。

T-96 regulates cell cycle-related pathways

CMT-7364细胞经30 μM T-96处理24 h后RNA-seq检出1452个DEGs（603上调、848下调），KEGG富集显示细胞周期通路显著受影响；网络药理学将MDM2鉴定为协调细胞周期阻滞与凋亡的核心枢纽；Western blot验证T-96下调抗凋亡蛋白Bcl-2，与转录趋势一致。结论：T-96通过调控细胞周期及相关通路影响TNBC增殖，MDM2为关键功能节点。

T-96 induces G1-phase arrest in the breast cancer cell cycle

T-96处理24 h后Western blot显示p21上调、MDM2下调；流式细胞术示三个细胞系G1期细胞比例随T-96剂量升高而增加，S期相应减少；同时p-RB(Ser⁷⁸⁰)、Cyclin B1、CDK2、Cyclin E1蛋白水平降低。结论：T-96通过下调MDM2、上调p21引起G1期细胞周期阻滞，抑制G1/S转换。

T-96 induces mitochondrial damage and apoptosis in TNBC

TEM观察T-96处理组线粒体出现外膜溶解、基质密度降低、嵴消失、内质网扩张等损伤；Annexin V-FITC/PI及TUNEL示凋亡率剂量依赖性升高；Western blot示促凋亡蛋白BAX、cleaved caspase-9、caspase-3上调，抗凋亡Bcl-2下调，BAX/Bcl-2比值升高，免疫荧光BAX表达增强。结论：T-96激活线粒体固有(intrinsic)凋亡通路，诱导TNBC细胞凋亡。

T-96 affects MDM2-p21 signaling in TNBC

分子对接预测T-96与MDM2结合能?6.0 kcal/mol，分子动力学模拟显示复合物较稳定；CETSA显示T-96使MDM2热稳定性右移，提示T-96可影响细胞内MDM2蛋白稳定性。MDM2过表达部分逆转T-96引起的迁移抑制、G1阻滞及凋亡激活；MDM2抑制剂SP141与T-96联用进一步增强p21、BAX、cleaved caspase-9上调及MDM2、p-RB、Cyclin E1、CDK2、Bcl-2下调。结论：MDM2–p21模块功能性介导T-96诱导的G1阻滞与线粒体凋亡，MDM2为关键功能介导因子而非直接结合靶标。

Pharmacokinetic study and safety evaluation of T-96 in vivo

BALB/c小鼠腹腔注射5 mg/kg T-96后，T_max=2.00 h，C_max=3057 ng/mL，t_1/2=23.5 h，平均滞留时间(MRT)=30.7 h，药物在24 h及48 h仍可检知；血常规与肝肾功能生化指标基本正常，心肝脾肺肾H&E未见显著病理异常，白细胞轻度下降可能为急性全身反应或药物暴露后分布改变。依据t_1/2与MRT建议给药间隔约48 h。结论：T-96腹腔给药具较长半衰期与良好短期耐受性。

T-96 inhibits the growth of breast cancer in vivo

4T1原位移植瘤小鼠给予T-96（2.5或5 mg/kg，隔日腹腔注射）后瘤体体积与重量显著减小，活体成像示肿瘤活性降低，H&E示瘤中心坏死增加，TUNEL阳性细胞增多，IHC示Ki-67及MDM2阳性细胞减少；5 mg/kg T-96显著抑制肺与肝转移灶数目；各组小鼠体重无明显下降，主要脏器无明显毒性表现。结论：T-96在体内显著抑制TNBC移植瘤生长并减少转移，且短期安全性良好。

讨论与结论总结

讨论指出本研究整合转录组、功能实验及体内模型证明T-96通过降低MDM2、升高p21引发G1期阻滞并激活线粒体凋亡，该作用在p53状态不同的TNBC模型中均可见，提示不限于p53野生型背景；MDM2虽非RNA-seq显著差异基因，但通过功能为中心的分析流程被识别为核心枢纽，经过表达回补与抑制剂协同实验验证其为功能介导因子。犬源CMT-7364细胞与人及鼠源细胞响应一致，支持比较肿瘤学转化意义。体内实验样本量较小(n=3/组)属初步概念验证，需更大样本确认。

结论翻译：T-96在犬、鼠及人乳腺肿瘤模型中均显示抗肿瘤活性，与MDM2下调及p21升高相伴随，引起G1期细胞周期阻滞和固有凋亡信号激活，并在体内减少转移而无明显短期毒性。鉴于CMTs高发且缺乏标准术后辅助化疗，本研究结果为T-96在兽医及比较肿瘤学研究——尤其是自发犬乳腺肿瘤模型中的进一步评价提供了临床前依据。