FTO调控的m6A去甲基化以及KIF11 mRNA的上调会促进糖尿病视网膜病变中的视网膜微血管功能障碍

《Journal of Translational Medicine》：FTO-modulated m6A demethylation and upregulation of KIF11 mRNA promotes retinal microvascular dysfunction in diabetic retinopathy

摘要

背景

N6-甲基腺苷（m⁶A）对mRNA的脱甲基化在糖尿病视网膜病变（DR）的进展中起着关键作用。据报道，脂肪质量相关蛋白（FTO）在DR中过度表达，并被认为是视网膜血管生成过程中重要的表观转录组调节因子（m⁶A去除剂）。然而，动力蛋白家族成员11（KIF11）基因在DR中的作用机制尚不清楚。

方法

使用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-Seq）技术检测增殖性DR（PDR）患者玻璃体样本中的异常m⁶A修饰。CCK-8和EdU实验用于检测人视网膜微血管内皮细胞（hRECs）的增殖和DNA合成情况，而Transwell实验、伤口愈合实验和管状形成实验则用于评估细胞的迁移和血管生成能力。此外，通过定量RT-PCR（qRT-PCR）和甲基化RNA免疫沉淀-RT-PCR（MeRIP-qRT-PCR）检测RNA及m⁶A修饰mRNA的水平；蛋白质水平通过Western blot进行检测。RNA结合蛋白免疫沉淀-RT-PCR（RIP-qRT-PCR）用于研究FTO与m⁶A修饰mRNA之间的相互作用。通过链脲佐菌素（STZ）诱导建立16周的糖尿病视网膜病变（DR）大鼠模型，每8周向玻璃体内注射5 μL AAV9病毒（1×10¹² vg/mL）。提取视网膜组织后进行Evans blue渗漏实验和视网膜胰蛋白酶消化实验，视网膜石蜡切片则进行苏木精-伊红（H&E）染色以及免疫组化或免疫荧光分析。

结果

MeRIP-Seq和RIP-RT-qPCR结果表明，KIF11可能是FTO的下游靶标。在PDR患者和高血糖条件下的hRECs玻璃体样本中，FTO和KIF11的表达水平升高，而KIF11的m⁶A甲基化程度降低。KIF11的过表达通过影响下游的PI3K/AKT/mTOR和β-连环蛋白/c-myc通路，增强了hRECs的增殖、DNA合成、迁移、伤口愈合和管状形成能力；而敲低KIF11则产生相反的效果。在STZ诱导的DR大鼠模型中，FTO和KIF11的过表达显著促进了视网膜渗漏、无细胞毛细血管形成、周细胞丢失、纤维化和胶质增生，而敲低FTO和KIF11则减轻了这些现象。

结论

我们的研究结果表明，FTO调控的KIF11mRNA的m⁶A脱甲基化为DR视网膜微血管功能障碍的临床治疗提供了潜在靶点。

图形摘要

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