《Archives of Microbiology》：Biosensors as transformative tools for multiplex detection of respiratory viral pathogens
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呼吸道病毒感染仍是全球重大公共卫生挑战，凸显了对快速、灵敏且可及的诊断方法的需求。传统诊断技术包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、病毒培养及酶联免疫吸附试验（ELISA），虽具备较高的分析性能，但常受限于基础设施要求、成本及周转时间，限制了其在分散化或资源
呼吸道病毒感染仍是全球重大公共卫生挑战，凸显了对快速、灵敏且可及的诊断方法的需求。传统诊断技术包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、病毒培养及酶联免疫吸附试验（ELISA），虽具备较高的分析性能，但常受限于基础设施要求、成本及周转时间，限制了其在分散化或资源有限场景中的应用。本综述批判性探讨了用于呼吸道病毒检测的生物传感器技术的最新进展，重点关注电化学生物传感器、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基生物传感器检测系统及新兴即时检测（POC）诊断平台。文中讨论了针对主要呼吸道病毒性病原体的生物传感器设计策略、检测机制、分析性能及临床适用性。此外，还分析了当前与临床验证、可扩展性、标准化及成本效益相关的挑战。总体而言，现有证据表明，基于生物传感器的诊断平台具有显著潜力，可作为现有实验室方法的补充，尤其在分散化和快速检测场景中。然而，在实现广泛临床应用之前，仍需开展大规模临床验证、监管标准化工作并将其整合至医疗工作流程中。
引言
呼吸道病毒感染是全球公共卫生的重大负担，每年导致大量发病与死亡。季节性流感病毒每年感染数百万人，在全球范围内造成数十万死亡；呼吸道合胞病毒（RSV）是婴幼儿和老年人群下呼吸道感染的主要病因；而严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）及严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）等新发病毒疫情，则展现了呼吸道病原体的大流行潜力及其压垮医疗系统的能力。这些流行病学趋势凸显了对快速、灵敏、可扩展的诊断方法以进行早期检测和疫情控制的迫切需求。目前，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）因具有高分析灵敏度和特异性，被视为呼吸道病毒检测的“金标准”。然而，病毒培养、RT-PCR及酶联免疫吸附试验（ELISA）等传统诊断方法常需要复杂的实验室基础设施、训练有素的人员及较长的周转时间，这极大限制了大规模筛查能力，尤其是在疫情暴发期或资源有限、需要快速临床决策的场景中。在此背景下，基于生物传感器的诊断平台成为极具前景的替代方案，其能够将生物相互作用实时转化为可测量的信号。生物传感器通常将抗体、核酸或酶等生物识别元件与能够产生电化学、光学或压电输出的换能器相结合。其中，电化学生物传感器因灵敏度高、成本低、便携性强且与即时检测（POC）形式兼容，受到了特别关注。近年来的技术进步已使生物传感器能够靶向多种病毒组分，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2型刺突蛋白、流感病毒血凝素等表面蛋白及病毒核酸。这些特性使生物传感器技术有望用于临床场景下的分散化检测、社区筛查及疫情监测。与RT-PCR和ELISA等传统诊断方法相比，基于生物传感器的平台并非要在所有临床场景中取代金标准检测，而是通过解决诊断可及性和周转时间的关键缺口来对其进行补充。虽然RT-PCR仍是分析灵敏度和特异性的基准，但其受限于集中化基础设施、专业人员需求及较长的处理时间；相比之下，生物传感器虽在异质性临床基质中的分析稳健性往往较低，但可提供更快的结果回报、最简化的样本前处理及即时部署能力。将生物传感器技术置于这种互补诊断范式中，对其转化相关性和真实临床效用的评估至关重要。因此，本综述旨在批判性评估用于呼吸道病毒检测的高性能生物传感器技术的最新进展，重点关注其分析性能、转化潜力以及在即时检测框架内作为既定诊断标准补充的作用。
呼吸道病毒性病原体
过去几十年间，多种新发与再现的呼吸道病毒疫情对全球公共卫生造成了显著影响。除2009年流感大流行和2020年新型冠状病毒肺炎大流行外，这类病毒在全球范围内导致了大量发病与死亡。呼吸道病毒源自腺病毒科、正黏病毒科、小核糖核酸病毒科、冠状病毒科及肺病毒科五大病毒家族，大多数为RNA病毒，且许多具有人畜共患起源。了解既往疫情的流行模式与特征，对改进未来的预防与缓解策略至关重要。2009年甲型H1N1流感（H1N1pdm09）病毒起源于墨西哥，随后迅速在全球传播，2009年至2010年间仅美国就造成约6080万感染病例和至少12469例死亡。这种类猪流感病毒至今仍在猪群和人类中流行，推动了流感病毒传播监测方法的改进。该病毒属于正黏病毒科RNA病毒。乙型流感病毒是一种有包膜的负义单链病毒，其基因组由8个节段组成，编码11种及以上病毒蛋白，包括聚合酶亚基（PA、PB1、PB2）、核蛋白（NP）、表面糖蛋白（HA、NA、NB）、基质蛋白（BM1）、离子通道蛋白（BM2）、非结构蛋白（NS1）及核输出蛋白（NEP）。目前已鉴定出7种人类冠状病毒（HCoVs），其中HCoV-NL63、-229E、-HKU1和-OC43通常引起轻度至中度季节性呼吸道疾病；2000年后出现的3种新型冠状病毒——严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）及严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）——则表现出较高的死亡率，其中SARS-CoV和MERS-CoV在部分国家引发流行，SARS-CoV-2则发展为大流行。所有人类冠状病毒均可在老年人和免疫功能低下患者中引发严重并发症。人类呼吸道合胞病毒（hRSV）现被归类为人类正肺病毒属，是肺炎病毒科成员，主要感染新生儿、免疫功能低下者及老年人，可引起发热、咳嗽、喘息等中度症状，也可导致细支气管炎和肺炎等严重表现，甚至需要住院治疗，据估计每年造成320万住院病例，其中140万为6个月以下婴儿。人类腺病毒14型（HAdV14）于2006年在美国再次出现，造成至少750例感染和13例死亡，现有数据显示其已传播至爱尔兰、加拿大和中国并持续流行，该病毒属于腺病毒科，无证据显示其人畜共患属性。鼻病毒C组（HRV-C）于2004年在纽约州一次流感样疾病暴发后被发现，在多个国家的秋冬季监测中均为鼻病毒的优势流行株，与鼻病毒A组和B组相比，HRV-C与更严重的呼吸道症状相关，包括哮喘、喘息、支气管炎和肺炎，且该病毒存在从人类向非人灵长类动物传播的证据，属于小核糖核酸病毒科RNA病毒。人类偏肺病毒（hMPV）于2001年在荷兰首次被发现，但推测其至少已流行50年，系统发育研究显示其约200年前从禽类祖先分化而来，在5岁以下儿童急性呼吸道感染中占比6%–40%，血清学调查显示几乎所有儿童在5岁时均已产生相应抗体，2016年前被归类为副黏病毒科亚科，现为肺病毒科成员。人类副流感病毒（HPIV）是急性呼吸道感染的重要病原体，可导致儿童喉炎和免疫功能低下者肺炎，分为4种主要血清型，为有包膜单链RNA病毒，属于副黏病毒科，其中HPIV-1和HPIV-3属于呼吸道病毒属，HPIV-2和HPIV-4属于腮腺炎病毒属，HPIV-1和HPIV-2感染儿童常表现为喉炎，HPIV-3则最常与肺炎和细支气管炎相关。
呼吸道病毒性病原体检测
传统的呼吸道病毒感染检测方法依赖病毒感染的细胞培养、核酸、病毒抗原及抗体检测，需要专业技术人员、笨重设备及大量时间投入，且临床实验室的细胞学、测序或电子显微镜检测流程也存在局限性。病毒分离培养是实验室识别呼吸道病毒的最可靠方法，成功分离后还需通过免疫荧光标记和电子显微镜进一步确证病毒存在，也可采用红细胞吸附法辅助判断，该方法虽精准，但长达4周的检测周期难以满足疫情暴发时的快速诊断需求。离心增强技术（壳小瓶法）等快速病毒培养技术的出现，将检测周期从一周缩短至1–2天，提升了流感病毒、登革热病毒等多种呼吸道病毒的分离效率。由于大多数呼吸道病毒体积过小，无法用光学显微镜直接观察，透射电子显微镜（TEM）是其直接检测的唯一手段，尽管已被PCR和免疫荧光分析等更灵敏的技术取代，但在新病毒鉴定、病毒表征及滴度评估等病毒学研究领域仍具重要价值，其核心优势是不依赖病毒特异性检测试剂，在未知病毒引发的广泛流行时可发挥关键作用，已在埃博拉病毒、SARS病毒及严重急性呼吸综合征冠状病毒2型的发现中得到验证，但设备运行成本高、空间及配套基础设施要求高，仅能在指定的认证中心开展。临床常规免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验（EIA）、放射免疫分析（RIA），依赖抗原-抗体相互作用，其中RIA使用放射性同位素标记的抗体或抗原，但因辐射风险被酶免疫分析（EIA/ELISA）逐步替代；化学发光免疫分析（CLIA）结合了免疫化学反应与化学发光技术，因灵敏度优异已在临床实验室常规用于蛋白检测，ELISA可检测低至10-12~10-9mol/L浓度的蛋白，已用于流感病毒鉴定。这类基于化学发光的血清学方法需要大型自动化设备，可通过检测感染后产生的免疫球蛋白M（IgM）判断急性感染，通过免疫球蛋白G（IgG）反映初次感染或继发感染急性期状态，但病毒进入机体后至抗体合成启动存在窗口期，可能导致免疫分析出现假阴性结果。核酸检测技术彻底改变了呼吸道病毒诊断格局，消除了假阴性窗口期影响，相较于传统培养方法灵敏度更高、稳定性更好、反应时间更短，通过将RNA逆转录为DNA并进行PCR分析，可在体外将特定DNA区域扩增106倍，实时RT-PCR检测流感的灵敏度与被视为病毒鉴定参考方法的细胞培养相当，且远快于终点检测法。用于严重急性呼吸综合征冠状病毒2型感染鉴定的cobas? SARS-CoV-2定性检测是基于核酸检测的新一代技术，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）紧急使用授权，可在cobas? 6800/8800系统上对符合临床或流行病学标准的患者的鼻咽拭子和口咽拭子样本进行定性检测，其中6800版本每日可检测1440份样本，8800版本每日可检测4128份样本，将冠状病毒鉴定时间较现有方法缩短十倍，为疫情防控释放宝贵资源，但核酸检测仍需配备完善的实验室和专业操作人员。综上，从病毒培养、透射电子显微镜到免疫分析和核酸扩增的传统诊断技术虽具备较高分析价值，但仍受限于长周转时间、对集中化实验室基础设施的依赖、对专业人员的需求，且难以适配分散化或快速检测场景，这些局限在疫情暴发、资源有限环境或需要快速临床决策时尤为突出，凸显了对能够在护理点附近实现快速、灵敏、可及检测的替代诊断平台的需求，基于此，生物传感器技术作为可弥补传统诊断流程固有缺口的互补工具应运而生。
生物传感器
感染性疾病的快速检测和及时启动适宜治疗是改善临床结局和公共卫生状况的关键因素。传统的体外感染性疾病检测流程繁琐，依赖集中化实验室、经验丰富的人员和笨重设备，而生物传感器技术的最新进展为实现即时诊断提供了可能，其在时效性、精确性和成本效益上有望达到或超过传统基准。生物传感器可将源自生物分子浓度的化学信息转化为可操作的检测信号，广泛应用于环境监测、过程控制、食品安全、医学诊断等诸多领域
