通过病毒递送微型CRISPR-Cas12f系统实现无转基因的植物基因组编辑

《Functional & Integrative Genomics》：Transgene-free plant genome editing via viral delivery of miniature CRISPR-Cas12f

摘要

将CRISPR试剂高效地递送到植物细胞中仍然是一个主要瓶颈，尤其是在无需转基因的情况下进行基因组编辑时。像烟草震颤病毒（TRV）这样的RNA病毒载体为瞬时表达提供了一个有吸引力的平台，但其载物容量有限。最近发现的微型核酸酶（如Cas12f）由于体积小且活性高，成为病毒递送系统的一个有前景的替代方案。在这项研究中，将经过植物密码子优化的Acidibacillus sulfuoxidans Cas12f（AsCas12f）与核定位信号融合后，克隆到TRV基因组中，从而开发出一个基于病毒载体的递送平台。通过Agrobacterium介导的渗透作用，将两条针对Nicotiana benthamiana PHYTOENE DESATURASE（NbPDS）基因的sgRNA递送到植物细胞中。为了提高移动性和转录本丰度，将可移动的RNA元件（如改良的Flowering Locus T（mFT）、截短的FLOWERING LOCUS T（tFT）和甲硫氨酸转移RNA（tRNA^Met）以及Pea early browning virus（PeBV）启动子整合到Cas12f和sgRNA构建体中。TRV介导的CRISPR-Cas12f递送在N. benthamiana的系统性叶片中诱导了靶向突变，这一结果通过持续的光漂白实验和Sanger测序得到了验证。带有tFT标签和tRNA标签的Cas12f构建体均提高了编辑效率，其中tRNA融合体表现出更强的活性。在PeBV启动子下表达Cas12f和sgRNA进一步增强了突变频率，其中pTRV2-PeBV::Cas12f-tRNA和pTRV2-PeBV::mFT-sgRNA构建体实现了最高的效率。这项研究建立了一个基于TRV的紧凑型CRISPR-Cas12f平台，实现了在植物中高效且无转基因的基因组编辑。该系统绕过了依赖于组织培养的转化过程，提供了一种符合生物安全要求的策略，可用于可扩展的非转基因作物改良。