活化低比重中性粒细胞(low-density neutrophil, LDN)来源的NGAL(neutrophil gelatinase?associated lipocalin, 脂质运载蛋白?2/LCN2)预测致死性发热伴血小板减少综合征(SFTS)：一项多队列与单细胞转录组研究

《Infection》：Hyper-activated low-density neutrophil-derived NGAL predicts fatal SFTS: a multi-cohort and single-cell study

目的　严重发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS）是一种进展迅速、病死率高的急性感染性疾病。本研究旨在评估血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase?associated lipocalin, NGAL；基因名 LCN2）对 SFTS 患者死亡风险的预测价值，并从单细胞水平阐明其细胞来源。 方法　本回顾性多中心研究纳入中国三家医院 215 例 SFTS 患者（训练队列 152 例，外部验证队列 63 例）。研究人员进一步分析已公开发表的 SFTS 患者及健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）单细胞 RNA 测序（single?cell RNA sequencing, scRNA?seq）数据，以探究 NGAL 的细胞来源。 结果　血清 NGAL 被确定为 14 天及 28 天全因死亡的独立危险因素（P＜0.05）。NGAL 高水平与死亡风险呈线性正相关，且在各临床亚组中保持稳定。关键的是，无偏倚 scRNA?seq 分析显示升高的 NGAL（由 LCN2 编码）主要来源于与 PBMC 共分离的低密度中性粒细胞（low?density neutrophils, LDNs）。这些表达 LCN2 的 LDNs 在死亡患者中显著富集，并表现出高炎症状态及干扰素刺激基因（interferon?stimulated genes, ISGs）转录特征。 结论　研究结果表明血清 NGAL 是 SFTS 患者死亡风险的可靠早期预测标志物，其升高与致病性高度活化 LDNs 的出现密切相关，为致死性 SFTS 的免疫病理机制提供了新见解。

论文解读：活化低比重中性粒细胞源性NGAL预测致死性发热伴血小板减少综合征(SFTS)——多队列与单细胞研究

研究背景与立项依据

严重发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS）由大别班达病毒（Dabie bandavirus, DBV，旧称 SFTSV）引起，以急性发热、血小板减少、白细胞减少及多器官功能障碍为特征，病情进展快、病死率高，对公共卫生安全构成严重威胁。目前虽在临床认知与支持治疗方面有所进展，但总体病死率仍居高不下，尤其老年及合并基础疾病者。现有文献报道的 SFTS 死亡风险生物标志物多缺乏外部验证、采血时点不统一，传统炎症指标亦难以在早期识别高危死亡患者。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase?associated lipocalin, NGAL；亦称 Lipocalin?2 / LCN2）除常用于急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）诊断外，在多种感染性疾病中与病情严重程度和不良预后相关；重症全身性感染时可诱发低密度中性粒细胞（low?density neutrophils, LDNs）——一类与 PBMC 共分离的活化中性粒细胞亚型——大量出现并被视作免疫介导损伤及不良结局的重要驱动因素。然而，NGAL 能否作为 SFTS 预后的可靠标志物、其升高是否反映此类病理性中性粒细胞失调，此前尚未见报道。为此，研究人员开展此项多中心回顾性队列结合公开 scRNA?seq 数据的临床—转录组整合研究，以明确血清 NGAL 对 SFTS 死亡风险的预测效能并阐明其免疫病理学细胞来源。

主要关键技术方法

研究人员开展回顾性多中心研究，训练队列 152 例 SFTS 患者（南京鼓楼医院、浙江大学医学院附属第一医院），外部验证队列 63 例（安徽医科大学第一附属医院），所有病例经 RT?PCR 确诊。入院 24 h 内采集血清，采用人 NGAL ELISA 试剂盒检测基线 NGAL 水平。临床数据通过标准化病例报告表收集，主要终点为 14 天及 28 天全因死亡。统计分析采用 Cox 比例风险模型、Kaplan?Meier 生存曲线、限制性立方样条（restricted cubic spline, RCS）及受试者工作特征（ROC）曲线分析。单细胞层面，研究人员下载 GEO 数据集 GSE175499（SFTS 患者及健康人 PBMC 的 scRNA?seq 数据，含可捕获的 LDNs），用 Cell Ranger(v3.1.0) 比对至 GRCh38 参考基因组，Seurat(v4.1.0) 进行质控（每个细胞 500–8000 个基因、线粒体基因＜25％）、降维（UMAP）、细胞类型注释——特别保留并注释经经典中性粒细胞标志（CSF3R、FCGR3B、CXCR2）鉴定的 LDNs 群体，排除双细胞及污染细胞；对 LDNs 再分群并进行差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析、KEGG / GO 功能富集及基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA）。

研究结果

基线特征（Baseline characteristics of patients with SFTS）

研究共纳入训练队列 152 例（存活 136 例，死亡 16 例），中位年龄 63.0 岁，男性占 42.8％。死亡组年龄更大、合并症比例更高、血清 NGAL 水平显著升高（P＜0.05）；死亡组器官衰竭发生率、受损及衰竭器官数目均显著高于存活组（P＜0.001）。按 NGAL 最佳截断值分层后，高 NGAL 组 28 天全因死亡率及器官衰竭发生率更高（P＜0.05）。

NGAL 与全因死亡的关系（The relationship between NGAL and all-cause mortality）

Cox 回归显示，NGAL 作为连续变量是 14 天（HR: 1.01, 95％CI: 1.005–1.016, P＜0.001）及 28 天（HR: 1.007, 95％CI: 1.002–1.011, P＜0.05）全因死亡的独立危险因素；二分类变量分析中 NGAL≥60.597 pg/mL 是 28 天死亡的独立危险因素（HR: 4.816, 95％CI: 1.468–15.793, P＜0.05）。Kaplan?Meier 曲线示高 NGAL 组 28 天生存率显著低于低 NGAL 组（P＜0.05）；RCS 显示 NGAL 水平与 14 天死亡风险呈正线性相关（P＜0.05）。亚组分析及敏感性分析（排除严重肾功能不全、排除高血压、调整临床分型及治疗策略、调整所有合并症）均证实上述关联稳健。

NGAL 对全因死亡的预测效能（The predictive efficacy of NGAL for all-cause mortality outcomes）

ROC 分析确定预测 28 天死亡的 NGAL 最佳截断值为 60.597 pg/mL，AUC 为 0.752；逐步回归筛选出的独立危险因素（年龄、NGAL、乳酸脱氢酶 LDH、总胆固醇 TC、高密度脂蛋白胆固醇 HDL?C、脂多糖 LPS）中，NGAL 的 AUC 数值高于 LDH 等其他指标。独立外部验证队列中 NGAL 对 28 天死亡维持良好预测能力，且优于其他筛选出的危险因素。

低密度中性粒细胞（LDNs）在致死性 SFTS 中富集并呈现特征性 LCN2 驱动转录谱（Low-density neutrophils (LDNs) are enriched in fatal SFTS and exhibit a distinct LCN2-driven transcriptomic profile）

对 GSE175499 数据集（4 例健康人、11 例存活者、4 例死亡者 SFTS 患者 PBMC scRNA?seq，共 95,739 个细胞）进行 UMAP 聚类，除 T/B/NK 细胞及单核细胞外在 PBMC 分选中鉴定出 LDNs。LDNs 及浆细胞样 B 细胞在 SFTS 患者中较健康人增多，死亡者中 LDNs 比例进一步升高。差异基因分析发现死亡者 LDNs 中 LCN2（编码 NGAL）显著上调；LCN2 转录信号主要富集于 LDN 群体，且死亡者 LDNs 内 LCN2 表达水平高于存活者。

LCN2 高表达于具高炎症及干扰素应答特征的特异性 LDN 亚群（LCN2 is highly expressed in a specific LDN subset characterized by hyper-inflammation and interferon responses）

从全数据集中提取 9,190 个 LDNs 再聚类为 5 个亚群（Neu_c0–Neu_c4），其中 Neu_c2 亚群 LCN2 表达最高，且该亚群在死亡患者中显著富集。GSVA 显示 Neu_c2 特异性激活干扰素 α 和 γ 应答通路；与主要表达颗粒蛋白（LTF、MMP8、CEACAM8）的 Neu_c3 比较，Neu_c2 显著上调干扰素刺激基因（interferon?stimulated genes, ISGs）如 IFITM3、IFIT1、IFIT3、ISG15；GO 富集见"防御应答病毒""调节炎症反应""应答Ⅱ型干扰素"显著富集。LCN2 在 LDNs 中共表达网络显示其与多个 ISGs 及颗粒蛋白强共表达，提示血清 NGAL 升高关联于致死性 SFTS 中高度活化、LCN2⁺ISG^highLDN 亚群的扩增。

讨论与结论翻译

本研究表明血清 NGAL 是 SFTS 患者 28 天死亡风险的独立预测因子，其升高在机制上与病死患者中 LCN2 高表达、具干扰素刺激特征的活化低密度中性粒细胞（LDNs）亚群扩增相偶联，反映严重的免疫失调。监测入院早期血清 NGAL 有助于临床识别高危死亡患者并指导强化支持治疗。局限性包括回顾性设计、样本量偏小、scRNA?seq 非存活者例数少及缺乏 LDNs 分泌 NGAL 蛋白的直接湿实验验证，未来需前瞻性大样本及实验验证完善。

结论（Conclusion）

综上，血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）与严重发热伴血小板减少综合征（SFTS）患者死亡风险密切相关，对 14 天及 28 天全因死亡具良好预测效能。该预后价值得到 LCN2 表达低密度中性粒细胞（low?density neutrophils, LDNs）在致死性病例中显著出现的机制支持，标志严重免疫失调状态。因此建议 SFTS 患者住院期间密切监测 NGAL