空间和单细胞图谱揭示钙化性主动脉瓣疾病中瓣膜间质细胞和巨噬细胞的性别差异

《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》：Spatial and Single-Cell Mapping Reveals Valvular Interstitial Cell and Macrophage Sex Differences in Calcific Aortic Valve Disease

背景：钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）进展为主动脉瓣狭窄的性别差异已在临床上有记载，但驱动主动脉瓣组织中性别依赖性纤维钙化的潜在细胞机制仍知之甚少。方法：研究人员通过组织学技术和扫描电子显微镜分析人主动脉瓣组织，以可视化和量化钙化位点。利用单细胞和空间转录组学探究驱动男性和女性人主动脉瓣组织中瓣膜间质细胞（VIC）和巨噬细胞基因表达在钙化位点附近的性别依赖性空间组织的机制。使用RNA原位杂交验证钙化位点附近的性别依赖性基因表达，并利用生物信息学工具进行细胞通讯分析，以确定性别依赖性的病理性细胞-细胞相互作用。结果：对来自健康患者和CAVD患者的主动脉瓣组织的组织学分析显示，与女性相比，CAVD男性主动脉瓣的瓣膜钙化面积增加。对异质性VIC群体的单细胞测序分析揭示了AP-1（激活蛋白1）转录因子复合物的男性偏向性基因表达和细胞外基质（ECM）重塑基因的女性偏向性表达。对组织学定义的钙化位点附近VIC群体的空间转录组学分析显示，男性依赖性COMP定位，而女性VIC中COMP表达非定位。与男性组织相比，纤维化密度增加的女性CAVD组织中编码PAI-1（纤溶酶原激活物抑制剂-1）的SERPINE1表达升高。女性CAVD组织还表现出相对于男性增加的巨噬细胞计数异质性，其中候选配体-受体相互作用（包括骨桥蛋白（SPP1）-CD44）被确定为炎症介导的CAVD的贡献因素。结论：研究人员的結果揭示了主动脉瓣组织中钙化位点附近VIC和巨噬细胞异质性和功能的性别差异。研究人员的結果强调了基于性别的转录组学分析对于理解导致主动脉瓣纤维钙化性别差异的细胞表型的重要性。

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD, calcific aortic valve disease）进展为主动脉瓣狭窄（AVS, aortic valve stenosis）是危及生命的过程，临床研究已报道男性和女性患者存在显著的性别差异：男性患者通常表现出更严重的异位钙化和瓣膜功能快速恶化，而女性患者则以纤维性瓣膜增厚为主，且瓣膜面积相对保留。然而，驱动这些性别差异的细胞和分子机制，特别是瓣膜间质细胞（VIC, valvular interstitial cell）和巨噬细胞在组织内空间组织上的差异，尚未得到深入解析。为填补这一空白，研究人员开展了本研究，旨在利用单细胞转录组学和空间转录组学技术，系统描绘人主动脉瓣中性别依赖性的细胞异质性和空间定位，为开发性别特异性治疗策略提供依据。该论文发表在《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》。

研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：首先，收集人体主动脉瓣标本（来自尸检心脏，经美国国家疾病研究互换组织及加州大学圣地亚哥分校伦理委员会批准），共纳入22例患者（女性10例，男性12例），根据Warren-Yong评分将患者分为健康组和CAVD组。利用组织学染色（茜素红、von Kossa、Masson三色）和扫描电子显微镜（SEM）观察并量化钙化和纤维化区域。通过单细胞RNA测序（10x Genomics Chromium平台，11例患者整合既往公开数据共12例）获得细胞图谱，并结合空间转录组学（10x Genomics Visium，6例患者）分析基因表达的空间分布。采用RNA荧光原位杂交（RNA-FISH，RNAscope）验证关键基因表达，利用CellChat进行细胞间通讯分析。

研究结果按以下小标题总结：
（1）**Histological Analysis of Human Aortic Valve Tissue Reveals Sex Differences in Valve Calcification and Morphology**：通过对健康与CAVD患者瓣膜的组织学分析，研究人员发现男性CAVD瓣膜的钙化面积百分比显著高于女性（22.6% vs. 7.9%），而纤维密度和瓣膜厚度在性别间无显著差异，但女性瓣膜在硬化和狭窄阶段厚度增加更明显。扫描电镜显示男性钙化颗粒大小异质性更大。
（2）**Single-Cell RNA Sequencing and Spatial Transcriptomics Reveal Sex Differences in Valve Cell Heterogeneity Driving Valve Fibrocalcification**：整合单细胞和空间转录组学数据，鉴定出四个主要细胞群：VIC、巨噬细胞、瓣膜内皮细胞（VEC, valvular endothelial cell）和T细胞。伪批量RNA测序分析揭示了性别偏向性的纤维化和钙化相关基因重叠。
（3）**VIC Subclustering Analysis Reveals Male-Specific VIC Association With the Transcription Factor Activator Protein 1**：VIC亚群分析鉴定出7个亚型（VIC 1-7）。其中男性CAVD中VIC 5比例增加，女性CAVD中VIC 4比例增加。差异表达分析显示男性VIC高表达FOS和JUN（形成AP-1转录因子复合物），女性VIC偏向ECM重塑基因和SERPINE1。上游调控分析提示女性偏向NOTCH1和YAP1信号。
（4）**VIC 2 COMP Gene Marker Clusters Near Sites of Calcification in Male Tissues**：空间转录组学结合Moran I统计发现COMP是男性组织中聚集性最强的基因之一，且COMP阳性VIC在男性组织中显著靠近钙化位点（平均距离62.6 μm vs. 女性469.3 μm），通过RNA-FISH验证了男性特异性COMP定位。
（5）**Validation of SERPINE1 as a Female-Biased VIC Marker in CAVD Tissues**：SERPINE1（编码PAI-1）在女性VIC中高表达且空间聚集，与纤维密度升高相关，RNA-FISH证实女性CAVD组织中SERPINE1⁺细胞比例显著高于男性（3.7% vs. 0.5%），且与内皮标志物SELE共定位率低，提示主要源于VIC。
（6）**Macrophage Analysis Reveals Sex-Biased Heterogeneities in Subcluster Functions and SPP1-CD44 Cell-Cell Interactions**：巨噬细胞亚群分析显示女性CAVD中Mac 2（炎症相关）比例增加（50.3% vs. 男性28.5%），且巨噬细胞表达SPP1（骨桥蛋白）与VIC上CD44受体的相互作用在女性中更显著。免疫荧光染色证实女性CAVD组织中CD68⁺SPP1⁺巨噬细胞比例更高且异质性更大。

讨论部分总结：研究人员通过空间转录组学揭示了VIC和巨噬细胞在钙化位点附近的性别依赖性基因表达特征。男性VIC中COMP和AP-1信号通路与钙化相关，而女性VIC中SERPINE1表达升高且SPP1-CD44介导的巨噬细胞-V细胞相互作用可能抑制钙化并促进纤维化。研究强调针对钙化位点附近的VIC群体进行性别特异性药物靶向的必要性。结论部分（原文Discussion末段）：研究人员的成果为解析主动脉瓣纤维钙化的性别依赖性细胞驱动因素提供了蓝图，为未来开发性别特异性治疗奠定了基础。研究在性别特异性背景下定义了细胞异质性，观察到男性中COMP靠近钙化位点的空间定位，与女性中SERPINE1表达和SPP1-CD44介导的巨噬细胞-VIC信号形成对比。研究结果提示AVS进展的性别差异不仅源于全身因素，更是瓣膜局部细胞微环境的结果。未来工作应优先靶向钙化区域附近的VIC群体，并利用空间转录组学技术确定性别特异性的表观遗传和旁分泌调控网络。多组学方法强调了在空间背景下理解瓣膜细胞异质性对于阐明瓣膜疾病性别差异及改善患者预后的重要性。