《Advanced Science》：Single-Cell Annotation and Localization via Integrating Spatial Transcriptomics Maps the Mouse Ocular Atlas and RAO Dynamics
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视网膜动脉阻塞（Retinal artery occlusion, RAO）是一种致盲性急症，亟需阐明其细胞时空动态以指导靶向治疗。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）功能强大但缺乏空间背景，而空间转录
视网膜动脉阻塞（Retinal artery occlusion, RAO）是一种致盲性急症，亟需阐明其细胞时空动态以指导靶向治疗。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）功能强大但缺乏空间背景，而空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）受限于细胞分割误差和低转录本捕获效率。为克服上述局限，研究人员开发了ASCAL（Automated Single-Cell Annotation and Localization）流程，整合两种互补的空间转录组技术：具备单核分辨率的SeekSpace作为细胞注释参考，以及具有均匀覆盖度的Stereo-seq（Spatiotemporal Closely-spaced Expression in situ sequencing）用于注释后细胞的定位。该策略仅需少量空间切片即可实现大规模scRNA-seq数据集的自动化注释与定位。利用ASCAL，研究人员构建了精确映射睫状体和视网膜各细胞类型的小鼠全眼单细胞空间图谱。此外，研究人员发现RAO模型中神经节细胞层（Ganglion Cell Layer, GCL）特异性富集显著的空间免疫激活，并通过免疫荧光染色验证。研究人员还揭示了活性视杆细胞（Rods）的选择性耗竭。重要的是，RNAscope实验独立验证了该活性Rod亚群的外周定位及其在RAO后的显著丢失。综上，本研究提供了全眼的综合空间细胞图谱，并为RAO的病理机制提供了新颖的单分辨率空间洞察，可作为解析眼部生理与病理景观的宝贵资源。
研究背景与意义
视网膜动脉阻塞（Retinal artery occlusion, RAO）作为致盲急症，其细胞层面的时空动态变化及靶向治疗依据尚不明晰。传统单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）虽能解析细胞异质性，却丢失了空间位置信息；现有空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）技术如10x Visium分辨率不足，高分辨率平台又依赖图像分割易产生边界识别错误、多细胞转录本混杂及低捕获效率，且成本高昂。此外，既往眼部单细胞研究多局限于视网膜等单一组织，缺乏涵盖全眼结构（如巩膜、睫状体）的高置信度空间图谱。针对上述问题，研究人员开发了ASCAL（Automated Single-Cell Annotation and Localization）整合分析流程，结合无图像分割的单核空间转录组技术SeekSpace与高均匀覆盖的Stereo-seq（Spatiotemporal Closely-spaced Expression in situ sequencing），旨在以最少空间切片构建小鼠全眼单细胞空间图谱，并解析RAO模型下的细胞与分子病理改变。该研究成果发表于《Advanced Science》。
主要关键技术方法
研究人员选用8周龄雄性野生型C57BL/6J及Apoe（载脂蛋白E）基因敲除小鼠，建立单侧翼腭动脉眼动脉阻塞（Unilateral Pterygopalatine Ophthalmic Artery Occlusion, UPOAO）模拟RAO模型，设假手术对照（CON）。对小鼠眼球行冰冻切片，分别进行SeekSpace（无分割单核空间转录组，获取单细胞分辨率带空间条形码的snRNA-seq数据）、Stereo-seq（亚细胞分辨率空间转录组，bin50汇总分析）及常规scRNA-seq（视网膜组织解离）。生物信息学上：以SeekSpace注释的细胞类型及空间坐标训练支持向量机分类器（eClassifier, SVM模型）用于scRNA-seq自动注释；利用CytoSPACE算法将注释后单细胞锚定至Stereo-seq空间坐标实现定位；对稀有的外周免疫细胞采用TopACT算法进行概率定位；以RCTD（Robust Cell Type Decomposition）对Stereo-seq spot进行细胞类型解卷积。实验验证采用免疫荧光（IBA1, CD14, Vim等）及RNAscope（Pde6a, Rbp3）。
研究结果
2.1 Single-Cell Resolution Spatial Transcriptome Profiling of the Mouse Eye With SeekSpace
研究人员对3张小鼠眼冰冻切片进行SeekSpace测序，获得17,835个单细胞分辨率细胞，中位UMI 413、基因254。结合解剖位置与标志基因（如Pax6为无长突细胞Amacrine Cells, ACs；Pde6a为视杆细胞Rods；Vim为Müller胶质等）将细胞划分为17类（6种视网膜细胞、3种胶质细胞、8种非视网膜细胞），显示明确的视网膜分层及空间邻域富集，确认SeekSpace构建了高置信度小鼠眼单细胞空间参考图谱。
2.2 Reference-Based Automated Cell-Type Annotation of Single Cells Across Distinct Regions of the Mouse Eye
研究人员基于SeekSpace数据训练SVM分类器（eClassifier），对独立视网膜及睫状体scRNA-seq数据进行自动注释。结果与无监督聚类一致性超86%，且能准确区分组织特异性细胞群（如睫状体高丰度基质细胞与视网膜高丰度Rods），证明eClassifier可消除人工标志物选择的偏倚，实现可靠自动化注释。
2.3 A Comprehensive Transcriptome Atlas of the Entire Mouse Eye Construction Using Stereo-seq as a Spatial Reference
Stereo-seq（bin50）检测到68%位点位于非视网膜区（SeekSpace仅21%），更均匀覆盖角膜、巩膜等周边组织，鉴定到大量组织特异性基因。以SeekSpace细胞类型为参考解卷积Stereo-seq spot，各spot主要细胞类型与解剖位置吻合，证实两平台数据一致且Stereo-seq弥补了SeekSpace组织覆盖率不足的缺陷。
2.4 Spatial Mapping of Single Cells Based on Stereo-seq
研究人员应用CytoSPACE将SeekSpace主要细胞类型映射至Stereo-seq切片获高覆盖空间图谱；对稀疏分布的外周免疫细胞用TopACT定位，发现生理状态下仅有极少外周免疫细胞渗入视网膜（<6%），主要驻留于眼外肌及结缔组织，经CD14免疫荧光验证符合血-视网膜屏障特性，确认Stereo-seq可作可靠空间支架。
2.5 Müller Glia Identified by Automated Annotation but Not Unsupervised Clustering
对Apoe KO小鼠RAO及对照视网膜scRNA-seq用eClassifier注释，发现无监督聚类将Müller胶质（Vim高表达）误拆分至C10/C14簇且无法单独识别（Jaccard指数最高仅0.04），而eClassifier能准确将其归为一类。对比SingleR、CellTypist、ScType及Seurat::TransferData，eClassifier在整体精度及Müller胶质召回率上均最优，表明空间引导的分类器能识别转录细微或异质群体。
2.6 Immune Activation Induced by RAO Localized in GCL
RAO后Müller胶质与微胶质（Microglia）比例升高，Müller胶质中Vim及应激相关基因上调。Stereo-seq显示Vim在神经节细胞层（Ganglion Cell Layer, GCL）与内网状层（Inner Nuclear Layer, INL）特异表达且RAO后GCL显著上调。TopACT预测微胶质在RAO第7天较对照增加十余倍且集中分布于GCL；IBA1免疫荧光及铺片共聚焦证实RAO后微胶质向内层视网膜迁移、形态呈活化态（突起缩短、分支减少），说明RAO引发GCL局限性的区室化神经炎症。
2.7 Topographic Distribution of Rod Subclusters
SeekSpace解析出5个Rod亚群，其中C1（高表达Rbp3，参与视觉循环与蛋白合成）定位于外核层（Outer Nuclear Layer, ONL）外周/远端，C4靠近眼球中心。RNAscope显示Rbp3信号（C1标志）确实比全Rod标志Pde6a更靠外层，验证了C1的外周空间定位。
2.8 A State-Dependent Vulnerability Within Rods Induced by RAO
尽管RAO总Rod数量稳定，eClassifier分析显示高活性C1 Rod亚群比例显著下降，CytoSPACE映射显示RAO切片C1减少、C4增多；已发表RAO批量RNA-seq中C1标志基因（含核糖体蛋白Rps15a）下调；RNAscope定量Rbp3阳性细胞较对照减半，证实RAO选择性耗竭翻译活跃、定位于ONL外层的Rod C1亚群。
讨论与结论
研究人员指出，ASCAL通过整合SeekSpace（单细胞分辨率、无图像分割、提供表达-空间联合参考）与Stereo-seq（亚细胞分辨率、均匀大面积覆盖、提供空间支架），突破了单一ST平台在分割、捕获效率及成本的瓶颈，仅需少量切片即可完成大规模scRNA-seq的高置信度自动注释与空间映射，优于激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection, LCM）。eClassifier在眼部细胞注释上超越主流工具，尤其能识别无监督聚类遗漏的Müller胶质。构建的小鼠全眼单细胞空间图谱填补了非视网膜区（如巩膜）单分辨率空白。应用于RAO模型揭示了以往bulk/scRNA-seq无法发现的区室化病理：GCL局限性微胶质/ Müller胶质激活，及总Rod数不变情况下高活性Rbp3+Rod亚群的选择性丢失，为RAO缺血再灌注损伤的机理研究与治疗靶点筛选提供了空间分辨的新依据。未来ASCAL可拓展至其他缺乏明确标志基因但具清晰解剖结构的组织。最终结论：ASCAL整合策略实现了基于空间信息的单细胞自动注释与定位，所绘制的鼠眼全器官空间图谱及RAO单细胞时空病理发现对该领域具有重要理论与资源价值。
