《Pathology International》：Advances in Visualizing Cytosine Methylation and Allele-Specific Epigenetic States in Tissue Context
表观遗传调控代表了一种可遗传且独立于DNA序列的转录调控层级，在发育、稳态维持及疾病进程中关键性地塑造着组织形态。尽管组蛋白修饰的免疫组织化学检测已在诊断病理学中得到广泛确立，但DNA甲基化——这一介导转录沉默、基因组印记和细胞身份识别的核心机制——的直接可视化仍面临更大挑战。为解决这一局限，研究人员已开发出一系列组织化学和细胞化学方法来检测形态学保存完整组织中的甲基化胞嘧啶。基于限制性内切酶差异敏感性的早期策略实现了CpG甲基化的整体原位评估，而依赖亚硫酸氢盐转化的挂锁探针杂交技术则通过转化依赖的甲基化与非甲基化胞嘧啶鉴别引入了序列特异性。近年来，ICON（Interstrand Complex formation for Observation of Nucleic acids，ICON）方法无需亚硫酸氢盐处理即可实现甲基化CpG位点的碱基分辨率检测，并具有单细胞精度，使得完整细胞核内等位基因特异性DNA甲基化（Allele-Specific DNA Methylation, ASM）的直接可视化成为可能。这些技术揭示了分化过程中单等位基因与双等位基因甲基化之间的动态转换，以成骨谱系中Rankl启动子的转变为例证。本综述总结了基于组织的DNA甲基化检测方法学进展，并强调空间分辨的序列特异性方法如何深化研究人员在组织学架构背景下对表观遗传调控的理解。
1 Introduction
表观遗传学被定义为独立于DNA序列、在有丝分裂和减数分裂中可遗传的基因调控变化，其提供了一个调控层级，在发育和细胞背景下塑造转录潜能。表观遗传机制并非与形态学孤立运作，而是作为遗传信息转化为健康和疾病组织特征性结构模式的关键决定因素而显现。在胚胎发生过程中，DNA甲基化和组蛋白修饰的动态变化重塑染色质结构以指导谱系定向、空间模式形成和组织构建。这些过程赋予细胞形成复杂器官所需的塑性，同时建立稳定的转录状态以维持形态学身份。此外，表观遗传调控持续于出生后整个生命过程，使组织能够结构上适应包括营养、氧化应激以及机械或炎症刺激在内的环境因素影响。这种适应能力构成了表型可塑性的基础，也阐明了表观遗传稳态扰动如何导致先天性异常、退行性疾病和肿瘤发生——其中异常染色质状态驱动病理性形态学改变。
成像技术、分子生物学和空间转录组学的进展使研究人员能够直接探究表观遗传状态在解剖结构中的分布。在临床诊断实践中，组蛋白修饰的免疫组织化学检测已获得广泛认可。H3K27M染色现已成为识别儿童弥漫性中线胶质瘤不可或缺的手段；H3K27me3的缺失用于诊断恶性外周神经鞘瘤；H3G34R/V免疫反应性则支持某些高级别儿童胶质瘤的分类。这些应用 exemplify 了基于组蛋白的表观遗传标记如何成为当代外科病理学的重要组成部分。
相比之下，DNA甲基化—— arguably 调控转录沉默、基因组印记和细胞身份识别的最基础表观遗传层级——尽管对塑造细胞表型具有核心作用，却远更难直接与形态学整合。为阐明其形态学后果，必须在完整组织学背景下而非仅凭批量或全基因组分子数据推断来考察DNA甲基化。因此，能够在原位检测DNA甲基化的组织化学和细胞化学方法的演进逐步扩展了该领域将表观遗传调控与组织结构相联系的能力。早期策略依赖于甲基化胞嘧啶或甲基结合蛋白的抗体检测，随后发展为酶学方法及提供更高空间分辨率的亚硫酸氢盐依赖方案。近年来，单细胞和空间分辨平台进一步提升了在完整组织学结构内可视化甲基化状态的能力。在此基础上，研究人员最近开发了一种碱基序列特异性的DNA甲基化原位检测方法，使得在确定的CpG位点直接可视化等位基因特异性甲基化（ASM）成为可能。利用该方法，研究人员捕获了分化过程中ASM（半等位基因）模式逐步转化为双等位基因甲基化的形态学转变。本综述概述了这些方法学进展，并阐明此类序列分辨细胞化学技术如何为DNA甲基化的空间动态及其对组织形态学影响提供新见解。
2 Immunohistochemical Detection of Methylated Cytosine: Principles, Applications, and Limitations
甲基化胞嘧啶（5-甲基胞嘧啶，5mC）及其氧化形式（5-羟甲基胞嘧啶，5hmC）的免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）检测为在组织形态学背景下可视化DNA甲基化提供了独特手段。与破坏组织构架的全基因组甲基化检测不同，IHC保存核和组织学完整性，使全局甲基化模式可与细胞分化、增殖和肿瘤性转化相关联。强核5mC染色通常指示稳定的分化状态，而染色丢失或异质性则反映基因组低甲基化或恶性去分化。相反，5hmC免疫反应性在神经、肝脏和再生组织中富集，但在多数癌症中显著降低，作为动态去甲基化的指标。由于该方法与福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）样本兼容，其能够实现临床材料的回顾性表观遗传学评估，并可与甲基CpG结合蛋白2（Methyl-CpG-binding Protein 2, MeCP2)或DNA甲基转移酶3β（DNA Methyltransferase 3 Beta, DNMT3B)等其他标记联合，以探索甲基化与转录调控之间的功能相互作用。
然而，必须认识到若干技术和解释性局限。由于5mC位于DNA螺旋内部，需要酸或热诱导变性以暴露表位，且染色结果关键依赖于修复条件。抗体特异性在不同商业克隆间存在差异，可能与5hmC发生交叉反应；因此，适当的对照不可或缺。该方法本质上是定性的：其可视化整体甲基化密度而非基因特异性模式，且不能产生绝对甲基化值。此外，严苛预处理可能损伤DNA，降低信号强度。因此，5mC和5hmC的免疫染色应被视为提供表观遗传组织空间洞察的补充性组织化学方法，最好与亚硫酸氢盐测序或空间甲基化组分析联合解读，以实现DNA甲基化原位的全面理解。
3 Restriction Enzyme-Based Histochemical Detection of DNA Methylation (Histo Endonuclease-Linked Detection of Methylation Sites of DNA, HELMET) Method
T. Koji及其同事于20世纪90年代末开发了一种在形态学保存的组织切片中可视化DNA甲基化的开创性方法。该方法采用限制性内切酶HapII和MspI，这一对同裂酶识别相同的回文序列（5′-CCGG-3′），但对胞嘧啶甲基化的敏感性不同：HapII在内部胞嘧啶甲基化时不能切割，而MspI则无论甲基化状态如何均能消化该序列。利用这一生化差异，建立了能够在原位区分甲基化与非甲基化DNA区域的限制酶-组织化学技术。在该方法中，FFPE切片首先经受可控的蛋白质消化和DNA变性以使染色质对酶可及。随后连续切片分别与HapII或MspI孵育，继而采用标记核苷酸进行原位切口翻译以可视化新产生的DNA末端。MspI消化而HapII抵抗的区域对应于甲基化CpG位点，从而能够在不同细胞群体间进行DNA甲基化的空间作图。这一创新方法首次使在完整组织学构架内观察表观遗传修饰模式成为可能，揭示了胚胎发育、配子发生和分化过程中的组织和细胞类型特异性甲基化谱。尽管HELMET方法基于甲基化敏感性限制酶的差异敏感性实现DNA甲基化的原位可视化，其主要局限在于缺乏CCGG之外的碱基序列特异性。因此，HELMET提供的是区域性而非位点特异性信息，无法直接评估精确基因组坐标处的表观遗传改变。
4 Padlock Probe-Based In Situ Detection of DNA Methylation Following Bisulfite Conversion
为克服抗体和限制酶为基础的组织化学技术的局限，研究人员团队开发了一种挂锁探针介导、超分支扩增的方法，可在FFPE组织切片中实现DNA甲基化的高灵敏度和序列特异性可视化。该方法最初建立于对继发性甲状旁腺功能亢进中p16
INK4a启动子甲基化的研究，其中CpG甲基化状态的细微差异与结节状和弥漫性腺体结构相关。该技术中，石蜡切片内的基因组DNA首先经受原位亚硫酸氢盐转化，将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶同时保存组织形态学。随后，针对亚硫酸氢盐转化后目标序列完全互补而设计的单链寡核苷酸挂锁探针与切片杂交。当 interrogated CpG位点的胞嘧啶甲基化时，相应挂锁探针完美退火并由DNA连接酶连接，形成闭合环状模板。环化探针继而经受超分支DNA扩增，产生大量可在光和荧光显微镜下检测的长串联滚环产物。该方法实现单细胞、CpG位点特异性分辨率，并能够直接比较组织学不同细胞群体间的甲基化异质性。
与传统亚硫酸氢盐测序不同，挂锁探针和超分支扩增方法在保留表观遗传修饰与细胞形态空间关系的同时，较5mC免疫组织化学检测具有更高特异性。其在分析甲状旁腺病变、肾小管或早期肿瘤灶等异质性组织方面尤为优势，其中区域性甲基化差异细微但生物学意义重大。因此，该策略代表了迈向形态学表观基因组学的方法学进展，将DNA甲基化谱分析与原位组织病理学构架相整合。
5 ICON Method: Chemical Complex Formation-Based Detection of Methylated Cytosine
ICON（Interstrand Complex formation for Observation of Nucleic acids, ICON）方法由A. Okamoto及其同事最初开发，代表了一种化学驱动、序列特异性的原位DNA甲基化检测方法，无需亚硫酸氢盐转化。该方法利用独特的链间复合物反应，其中特别设计的寡核苷酸探针通过选择性化学交联与甲基化胞嘧啶残基形成共价加合物。ICON探针由此直接识别双链DNA中确定CpG位点的甲基化胞嘧啶，提供可在形态学保存的细胞或组织切片中可视化的碱基序列特异性信号。
与传统免疫组织化学或亚硫酸氢盐分析不同，ICON技术依赖化学识别而非酶消化或表位暴露。在温和变性条件下ICON探针与基因组DNA杂交后，甲基化依赖的链间复合物通过交联反应稳定化。为进行信号放大，ICON探针的3′端含有滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）引物序列，使环化DNA模板得以进行后续等温扩增。扩增产物可使用生物素或荧光标记的互补探针检测，实现单细胞分辨率下甲基化位点的高灵敏度光学显微镜观察。该扩增步骤显著增强检测灵敏度，同时维持甲基化序列的精确定位。
ICON方法由此提供了序列特异性、无亚硫酸氢盐处理需求的DNA甲基化可视化有力工具，将甲基胞嘧啶识别的化学特异性与RCA信号放大的灵敏度相结合。其在保存核和组织形态学同时检测确定基因组位点的能力，使其高度适用于形态学表观遗传学应用，架起了化学生物学与组织病理学之间的桥梁。
6 Allelic Asymmetry in DNA Methylation: Monoallelic and Biallelic Regulation
DNA甲基化可发生于单等位基因（仅影响一个亲本等位基因）或双等位基因（平行修饰两个等位基因）。经典的单等位基因系统包括基因组印记和X染色体失活，其中亲本来源效应或剂量补偿效应导致单个等位基因的选择性沉默。除了这些充分表征的机制外，全基因组分析揭示ASM远比先前认识更为普遍。高分辨率亚硫酸氢盐测序鉴定了众多与非印记ASM位点相关的位点，其存在顺式作用序列多态性、等位基因偏倚转录因子占据或染色质可及性变异，表明ASM代表了遗传变异与表观遗传调控之间的广泛调控界面。最近生成的全面人类ASM图谱进一步证明，等位基因特异性甲基化跨越约6%的基因组，包含约325,000个区域和11%的所有CpG位点。除已知印记位点外，还鉴定了近400个此前未被识别的亲本来源ASM区域，其中许多表现出显著的细胞类型特异性。
已报道的非印记ASM功能和病理作用可概括如下：顺式作用变异（包括CpG-单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）产生等位基因偏倚转录因子结合并调节增强子活性；ASM通过与等位基因特异性表达平行来精细调节基因剂量；ASM通过CTCF（CCCTC-Binding Factor）介导的绝缘子和改变的增强子-启动子通讯等机制塑造染色质结构；组织和细胞类型限制的ASM有助于细胞身份识别；ASM在全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）位点的富集提供了遗传风险变异与转录后果之间的机制联系；癌症相关ASM改变等位基因特异性抑制或激活，促进肿瘤内异质性。
单等位基因与双等位基因甲基化之间的平衡可在发育和疾病过程中动态转换。在癌症中，ASM改变与印记丢失和全基因组低甲基化共同扰动基因剂量并驱动克隆多样化。单细胞和克隆分析进一步揭示，单等位基因甲基化常平行于单等位基因表达，这是一种广泛的常染色体现象。这种表观遗传不对称性增加了调控变异性，可能影响表型多样性和疾病易感性。
总之，单等位基因DNA甲基化曾被视为例外，现已被理解为一种灵活的、情境依赖的调控层级，叠加于经典的双等位基因甲基化组之上。
7 Methodological Approaches to Detect Allele-Specific DNA Methylation
ASM检测的基石方法是亚硫酸氢盐转化后测序，其区分甲基化与非甲基化胞嘧啶，并利用附近SNPs进行甲基化状态定相。近年来，牛津纳米孔和PacBio HiFi等长读长测序平台实现了甲基化胞嘧啶的直接、无转化测量，解析跨越兆碱基尺度的等位基因甲基化。与染色质构象检测和等位基因特异性转录组学的整合提供了ASM如何塑造染色质可及性和单等位基因表达的多维洞察。空间和单细胞技术的进展扩展了原位检测ASM的能力。单细胞亚硫酸氢盐方法（scBS-seq, snmC-seq）揭示发育和肿瘤演化过程中的细胞类型特异性ASM动态。基于成像的方法——包括挂锁探针亚硫酸氢盐杂交、ICON和甲基化敏感性荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）——允许在完整核内直接可视化等位基因特异性甲基化，将序列水平表观遗传学与组织学构架相连接。这些分子和组织化学工具共同建立了检验组织中ASM如何组织和调控的有力框架。
8 Novel Application of the ICON Method Reveals Allele-Specific DNA Methylation Dynamics During Osteoblast Differentiation
序列特异性原位甲基化分析的显著优势在于其保留空间和形态学背景的同时 interrogating 位点特异性表观遗传改变。与提供异质性细胞群体平均信号的批量或全基因组甲基化谱分析不同，这些方法能够在组织学完整的组织中直接可视化确定基因组位点的甲基化状态。该特性在肿瘤病理学中尤为相关，其中肿瘤内异质性和微环境相互作用发挥关键作用。通过将甲基化信号与常规组织形态学整合，原位方法可提供额外的诊断洞察，尤其当表观遗传改变呈空间限制性时。然而，这些技术在常规诊断中的应用受技术复杂性、探针设计要求和标准化及定量解读挑战的限制，需要进一步的方法学完善和临床验证。
ICON方法具有高灵敏度和单细胞空间分辨率，能够在形态学定义的细胞微环境中分析ASM。利用该方法，研究人员检测了成骨细胞分化过程中Rankl启动子TATA盒附近CpG甲基化。Rankl表达在皮质骨中遵循特征性的开-关-开模式，对应于成骨细胞成熟和骨重塑。ICON分析揭示了从早期阶段的单等位基因甲基化到后期阶段双等位基因甲基化的转变，与转录抑制巧合。这种等位基因转换为稳定成骨细胞成熟过程中的关闭状态提供了合理机制。重要的是，常规亚硫酸氢盐方法无法区分中等甲基化水平是反映细胞群体异质性还是单个细胞内的等位基因特异性修饰。相比之下，ICON能够在单细胞分辨率下直接可视化等位基因甲基化状态，证明成骨细胞中的单等位基因甲基化在分化过程中转变为双等位基因甲基化。这些发现说明了ASM如何在空间组织化的组织背景下促进转录调控。
三种原位检测方法的甲基化信号分布存在差异，ICON在单细胞水平提供增强的空间分辨率和信号保留。ICON将甲基化信号定位于确定组织学结构内的能力，凸显了其作为空间表观遗传分析补充工具的潜力。
9 Clinical and Spatial Epigenomics in Diagnostic Pathology
除空间转录组学和甲基化组分析外，空间染色质可及性检测如空间ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）最近成为研究完整组织背景中表观遗传调控的有力工具。空间ATAC-seq提供染色质可及性的全基因组信息，能够跨组织结构识别调控元件和细胞类型特异性染色质状态。然而，这些方法不能直接评估特定位点的DNA甲基化。相比之下，序列特异性原位甲基化检测方法允许在保存组织学结构的同时直接可视化确定基因组区域的甲基化状态。因此，这些方法提供互补视角：空间ATAC-seq捕获全局染色质可及性景观，而原位甲基化分析提供单细胞分辨率下的位点特异性表观遗传信息。这些方法的整合可能通过将染色质可及性与形态学定义组织环境中的DNA甲基化相联系，促进对表观遗传调控的更全面理解。
DNA甲基化谱分析的近期进展显著扩展了其在诊断病理学中的临床适用性。全基因组甲基化特征已成功用于肿瘤分类，尤其在诊断困难的实体中，提供与临床病理特征和某些情况下患者预后相关的客观、可重复分子分层。同时，新兴的空间分辨甲基化组技术开始实现形态学保存组织背景中表观遗传改变的可视化，从而弥合分子谱分析与组织病理学解读之间的差距。此外，空间甲基化数据与其他组学层级（包括转录组学和蛋白质组学）的整合促进了空间多组学平台的发展，为组织结构和疾病异质性提供更全面理解。这些国际研究中报道的进展突出了表观遗传谱分析作为研究工具以及常规诊断工作流程潜在辅助手段的日益重要性。然而，需要进一步验证、标准化和成本效益实施，才能将这些方法完全纳入临床实践。
原位DNA甲基化检测对FFPE组织的适用性是其在诊断病理学中潜在应用的重要考量。FFPE标本代表常规病理评估的标准格式，构成大量存档临床材料的资源。然而，FFPE组织的使用呈现若干技术挑战，包括甲醛固定引起的DNA片段化、交联和探针可及性降低，所有这些均可能影响甲基化检测的灵敏度和特异性。此外，需要优化预处理条件、探针设计和信号放大策略以在此类标本中获得可靠结果。
尽管存在这些局限，近期方法学进展表明，序列特异性原位甲基化技术对FFPE组织的适应可能是可行的。探针化学、信号检测系统和组织处理方案的改进有望增强性能和可重复性。如成功实施，这些方法将能够在常规处理的病理标本中直接可视化位点特异性甲基化模式，从而提供临床相关的空间表观遗传信息。此类进展将进一步支持原位甲基化分析向诊断工作流程的整合，并扩展其转化潜力。
10 Conclusion
空间表观遗传和转录组技术（包括Visium及其他高分辨率平台）的最新进展，现已使调控状态在组织结构中的分布得以直接考察。这些发展突出表明，等位基因特异性DNA甲基化是一种动态调控层级，可在发育和病理背景下于单等位基因和双等位基因状态之间转换。皮质骨中的观察说明此类转变伴随Rankl表达的谱系依赖性变化， exemplify 了等位基因甲基化如何促进快速且空间协调的基因调控。这些方法共同强调了将分子表观遗传信息与形态学整合，以更精确理解染色质状态如何塑造健康和疾病中组织组织的重要性。
