自组装纳米囊泡集成贴剂介导中药复方经皮递送以高安全性缓解失眠

《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Self-assembled nanovesicles integrated patch mediated transdermal delivery of Chinese medicinal formula alleviates insomnia with high safety

失眠是一种高发的神经系统疾病，其特征在于神经递质失调、炎症以及氧化应激。由于现有治疗通常依赖单一靶点调控机制，因此疗效常受到限制。益念金（YNJ）是一种经典复方，在治疗失眠方面具有多重治疗作用。然而，YNJ 传统口服递送存在显著局限，包括朱砂释放所致 Hg²⁺ 蓄积，以及活性成分生物利用度有限，进而同时导致毒性问题和疗效受限。为解决上述多重障碍，研究人员构建了一种肽自组装穿透纳米囊泡并将其整合入控释基质中，形成益念金贴剂（YNJP）。其中，朱砂被包封于经细胞穿透肽 YGRKKRRQRRR（TAT）和肠壁穿透肽 CSKSSDYQC（CSK）功能化的纳米囊泡中，形成 TAT/CSK-朱砂囊泡（TCCV），并进一步整合入载有其他草药成分的控释聚合物基质中，构成杂化贴剂。结果表明，YNJP 可显著增强朱砂跨越角质层（SC）、腹部脂肪及小肠肠壁的序贯穿透，同时对其他草药成分的经皮递送亦表现出明显疗效。与传统口服 YNJ 相比，YNJP 可使主要器官中 Hg²⁺ 蓄积显著降低 58.3%–85.8%。除通过抑制炎症和氧化应激缓解失眠外，YNJP 还可恢复脑-肠轴介导的 5-羟色胺（5-HT）释放及 5-HT_1A 受体（5-HT_1AR）激活。该研究表明，YNJP 是一种安全且创新的中药复方经皮递送平台，适用于同时含有多种同源成分和毒性成分的中药制剂，并为失眠等复杂性疾病提供了一种兼具高效性与生物安全性的新型中医药治疗方案。

该文发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》，围绕“含毒性矿物成分中药复方如何在保证疗效的同时降低系统毒性”这一关键问题，提出了一种面向失眠治疗的新型经皮递送策略。研究背景在于：失眠是常见神经系统疾病，涉及神经递质紊乱、炎症反应和氧化应激等多重病理过程，现有治疗方式多以单一靶点药物或传统口服方案为主，常伴随生物利用度不足、疗效不稳定、复发及不良反应等问题。益念金（YNJ）作为具有较长临床应用历史的经典复方，兼具多成分、多机制干预优势，但其含有朱砂（HgS），传统口服应用存在 Hg²⁺ 蓄积风险，且粗粉口服也会导致植物药活性成分释放不足、胃肠降解明显与吸收受限。因此，如何实现复方整体高效递送并同时降低朱砂相关毒性，构成该研究开展的直接动因。

为解决上述问题，研究人员设计了肽自组装功能纳米囊泡集成贴剂益念金贴剂（YNJP）。该体系以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为控释骨架，将超声纳米化后的朱砂包封于由聚氧乙烯（40）硬脂酸酯与胆固醇构成的囊泡中，并进一步表面修饰细胞穿透肽 TAT 与肠壁穿透肽 CSK，形成 TAT/CSK-朱砂囊泡（TCCV）。随后，TCCV 与大黄、牵牛子、槟榔、人参等其余药材成分共同整合入贴剂基质，从而以经皮替代口服方式，建立兼具皮肤穿透、控释和后续肠道相关递送特征的复合平台。研究结论显示，YNJP 不仅显著改善了复方成分的持续释放和经皮转运，还明显降低了 Hg²⁺ 在主要器官中的蓄积，并通过抑制炎症、减轻氧化应激、恢复脑-肠轴相关 5-HT 释放以及激活脑内 5-HT_1AR 发挥抗失眠作用，体现出良好的疗效-毒性平衡与潜在临床转化价值。

在技术方法方面，研究主要采用以下几类关键手段：首先构建并表征 TAT/CSK 功能化朱砂纳米囊泡及其控释贴剂体系，应用透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见吸收光谱、粒径分析、高效液相色谱（HPLC）和电感耦合等离子体（ICP）进行质量评价；其次，利用 Franz 扩散池、活体/离体荧光成像和小鼠体内药代分布实验评价经皮释放、穿透和器官分布；再次，在 H₂O₂ 诱导 PC12 细胞损伤模型、IFN-γ 诱导 RAW264.7 极化模型及 PCPA 联合睡眠剥夺 C57BL/6 小鼠模型中评估药效；同时结合酶联免疫吸附测定（ELISA）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、Western blot、免疫荧光、16S rRNA 测序、粪菌移植（FMT）及抗生素清除菌群等方法，解析脑-肠轴相关机制。动物样本主要来源于 SPF 级雌性 C57BL/6 小鼠，肠道菌群测序样本来源于各实验组粪便。

3.1. Preparation and characterization of YiNianJin patch (YNJP)
研究人员首先完成了 YNJP 的制备与理化表征。结果显示，TCCV 成功构建，TAT 和 CSK 在囊泡表面的接枝效率较高，平均粒径约为 269 ± 5.8 nm，包封率与载药率均处于较高水平，并在一定时间内保持稳定。TEM 和 SEM 结果表明，TCCV 呈球形并稳定附着于贴剂基质中。优化后贴剂具备较好的黏附性能、机械强度、成形性和微生物学质量，且所含总蒽醌、牵牛子苷、槟榔碱、人参皂苷及 Hg²⁺ 含量均符合既定标准，说明该制剂体系在结构与质量控制层面具备可行性。

3.2. Release and transdermal delivery of components from YNJP in vitro
通过 Franz 扩散池实验，研究人员发现，与朱砂粉末和传统 YNJ 相比，YNJP 对 Hg²⁺ 及其余中药活性成分均表现出更优的缓释特征和更强的经皮渗透能力。总蒽醌、牵牛子苷、槟榔碱和人参皂苷的释放效率与皮肤穿透效率均高于 YNJ，而皮内残留差异不显著。这说明贴剂骨架与纳米囊泡协同作用，可在不增加局部蓄积的情况下提高有效递送效率。

3.3. Transdermal delivery and biodistribution of components from YNJP in vivo
体内分布研究进一步证实，YNJP 经皮给药后可显著减少 Hg²⁺ 在肝、肾、脑和血液等组织中的蓄积，相比口服 YNJ 降低幅度为 58.3%–85.8%。同时，小肠中 Hg²⁺ 水平升高，提示 CSK 修饰囊泡具备肠壁穿透能力。离体成像未见脑、心、肺、肝、肾、脾等器官明显荧光信号，而小肠和大肠可见显著信号，支持“经皮释放—组织穿透—肠道富集”的递送特征。与此同时，四味植物药活性成分在血浆中的释放更平稳、更持久，表明 YNJP 可提高生物利用度并稳定体内暴露水平。

3.4. In vitro therapeutic effects of YNJP in insomnia
在 H₂O₂ 诱导的 PC12 细胞损伤模型中，YNJP 在适宜浓度下较 YNJ 显示出更优的细胞保护作用。研究人员通过细胞活力、凋亡、活性氧（ROS）及迁移/侵袭相关实验发现，YNJP 能显著抑制 H₂O₂ 引发的细胞损伤，降低 Caspase-3 表达、减少 ROS 生成，并提高细胞活性。ELISA 结果显示，YNJP 能下调 TNF-α、IL-1β 和 IL-6，上调超氧化物歧化酶（SOD）与谷胱甘肽（GSH），并降低丙二醛（MDA）和乳酸脱氢酶（LDH）水平，说明其具有明确的抗炎和抗氧化应激活性。

在 IFN-γ 诱导的 RAW264.7 细胞模型中，研究人员进一步验证了其免疫调节作用。YNJP 降低了 M1 型巨噬细胞相关标志物 CD86 和 iNOS，升高了 M2 型标志物 CD206，同时在蛋白和 mRNA 水平均抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6 表达，提示其可能通过促进巨噬细胞由促炎 M1 向修复型 M2 极化转变而减轻炎症反应。

3.5. In vivo therapeutic effects of YNJP in insomnia
在 PCPA 联合睡眠剥夺建立的失眠小鼠模型中，YNJP 显著改善了多项行为学指标。尾悬实验（TST）和强迫游泳实验（FST）中，YNJP 均明显延长静止时间；转棒实验显示其可改善模型鼠平衡能力、停留时间及运动距离；在戊巴比妥钠和水合氯醛诱导睡眠模型中，YNJP 可缩短睡眠潜伏期并延长睡眠时间。总体来看，YNJP 的疗效优于口服 YNJ，并优于阳性对照透皮贴剂 DingGuiErQi patch（DGE）。此外，其对体重下降和器官系数异常也有一定改善，H&E 染色结果进一步支持其在给药周期内具有较好安全性。

3.6. In vivo mechanism of YNJP in insomnia relief
机制层面，YNJP 对睡眠剥夺所致海马损伤表现出保护作用。Nissl 染色显示，其可减轻神经元损伤并提高 Nissl 小体密度。免疫荧光结果表明，YNJP 显著上调脑源性神经营养因子（BDNF）和突触素（SYP）表达。由于 BDNF 与神经可塑性和认知调控密切相关，SYP 参与突触囊泡内神经递质储存和释放，这些结果说明 YNJP 可能通过改善神经营养支持及突触功能，促进失眠相关神经损伤修复。

3.7. Anti-inflammatory and antioxidant effect of YNJP in vivo
在体内，YNJP 同样展现出系统性抗炎和抗氧化作用。ELISA 结果显示，YNJP 降低了模型鼠体内 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平；脾脏免疫荧光结果提示 iNOS 和 TNF-α 表达下调，说明其可抑制睡眠剥夺诱导的外周炎症反应。与此同时，YNJP 提高 SOD 和 GSH 水平，降低 MDA 与 LDH，提示其能缓解多器官氧化损伤。这些体内结果与细胞实验结论一致，说明其抗失眠效应与炎症抑制和氧化应激改善密切相关。

3.8. Unraveling the brain-gut axis-mediated mechanism of YNJP in insomnia relief in vivo
该研究的重要创新之一，是将 YNJP 的作用机制延伸至脑-肠轴。16S rRNA 测序显示，模型组肠道菌群丰度下降、群落结构异常，而给药后菌群组成得到恢复。YNJP 增加了多种有益菌相对丰度，包括 Ligilactobacillus、Saccharimonospora 和 Bifidobacteria，并降低了模型组中升高的潜在不利菌群。进一步检测发现，YNJP 显著缓解了睡眠剥夺所致肠道及脑内 5-HT 耗竭，并提高脑内 5-HT_1AR 蛋白表达；Western blot、RT-qPCR 和免疫荧光结果相互印证。加入 5-HT_1AR 拮抗剂 WAY-100635 后，这一上调作用被逆转，支持 5-HT_1AR 参与其抗失眠机制。与此同时，粪菌移植可复制部分治疗效应，而抗生素清除菌群后 YNJP 的有益作用受到阻断，进一步说明其疗效与肠道微生物驱动的脑-肠轴调控相关。

3.9. Safety assessment
安全性评价显示，YNJP 对人永生化角质形成细胞（HaCaT）和人皮肤成纤维细胞（HSF）无明显增殖抑制作用，并可减轻 H₂O₂ 诱导的正常肝细胞（L-02）凋亡。动物实验中，血生化和血液学指标未见显著异常，提示其整体生物安全性较好。兔皮肤刺激实验未见明显红斑、水肿、出血或角质层明显破坏，经皮水分流失（TEWL）亦无显著变化。长期毒性比较进一步表明，与口服 YNJ 相比，YNJP 在 1、30、60 d 时均显著降低多器官汞蓄积，尤其在脑、肝、肾等关键靶器官中的沉积明显减少，体现出经皮递送在减毒方面的突出优势。

讨论部分表明，本研究的核心价值在于以纳米囊泡包封和贴剂控释相结合的方式，对传统含朱砂复方进行了递送方式重构。该策略既绕开了胃肠降解和首过效应，又通过 TAT/CSK 功能化实现了皮肤穿透与肠壁相关递送，兼顾了多成分复方的整体性与朱砂的减毒需求。研究结果证明，YNJP 通过降低 Hg²⁺ 蓄积、提升活性成分持续暴露、抑制炎症和氧化应激、修复神经营养信号，并调控肠道菌群—5-HT—5-HT_1AR 轴，从多个层面改善失眠表型。文章同时指出，该平台为含毒性成分中药制剂的现代化改造提供了技术原型，也为脑-肠轴靶向睡眠障碍治疗提供了新的研究路径。

研究结论部分可译为：研究人员成功开发了一种用于失眠治疗的肽自组装功能纳米囊泡集成益念金贴剂（YNJP）。该制剂作为一种有前景的经皮治疗策略，在显著增强治疗效果的同时降低了系统毒性，表现出优越的疗效-毒性特征。机制研究表明，YNJP 通过多通路调控发挥抗失眠作用，包括减轻炎症反应和氧化应激反应，以及通过促进 5-羟色胺（5-HT）生成激活脑内 5-HT_1A 受体（5-HT_1AR）。未来研究应重点通过系统药代动力学和安全性评价以及人体试验，进一步验证 YNJP 的临床转化可行性。