基于1α,25-二羟基维生素D3与脂质纳米粒的核递送策略用于慢性阻塞性肺疾病的根治性治疗

《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：A nuclear delivery strategy for curative treatment of COPD using 1α,25-dig hydroxyvitamin D3 and lipid nanoparticles

慢性阻塞性肺疾病（COPD)以阻塞性通气功能障碍为特征。由于目前尚无药物能够再生已破坏的肺泡，亟需开发修复肺泡损伤的新疗法。研究人员此前已报道1α,25-二羟基维生素D₃(1,25(OH)₂D₃)在COPD模型小鼠中显示出肺气肿改善作用。然而，由于1,25(OH)₂D₃存在高钙血症等严重不良反应风险，需要制定降低风险的策略以实现进一步减量。为解决该问题并实现高效的细胞内药物递送，研究人员关注使用SS-可断裂质子激活型类脂材料O-Phentyl-P4C₂(COATSOME?SS-OP；以下简称"SS-OP")及辅助脂质作为脂质纳米粒的组成成分。本研究以两种辅助脂质——1,2-二油酰基-sn-丙三醇-3-磷酸胆碱(DOPC)或1,2-二油酰基-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺(DOPE)制备的1,25(OH)₂D₃包封SS-OP脂质纳米粒(SLPs)——为对象，考察了细胞内药物递送、肺气肿改善效果及不良反应风险的降低情况。仅使用DOPE制备的1,25(OH)₂D₃包封SLPs实现了高效药物递送，相对于游离1,25(OH)₂D₃增加了核转位，并能在更低剂量下成功诱导肺细胞分化及呼吸功能改善。此外，使用基于DOPE的1,25(OH)₂D₃包封SLPs降低了升高的血清Ca²⁺水平，该制剂有望成为COPD的治疗候选药物。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以支气管阻塞和肺泡破坏导致永久性气流受限为特征的难治性呼吸系统疾病，位居全球死亡原因第三位。肺泡作为远端气道的终末结构，是气体交换的核心场所，其表面覆有I型和II型肺泡上皮细胞。在COPD中，肺泡结构的不可逆破坏损害了气体交换功能，因此通过肺泡上皮祖细胞分化为I型或II型上皮细胞来实现肺泡再生，被认为是恢复肺功能的潜在策略。然而，目前尚无可用于再生肺泡的药物，亟需开发能够修复破坏肺泡的根治性治疗方法。

随着组织修复再生医学重要性的日益增长，肺再生已成为COPD的有前景治疗策略。研究人员既往的体外和体内实验表明，1α,25-二羟基维生素D₃(1,25(OH)₂D₃)具有诱导肺泡细胞分化的作用，对COPD治疗具有应用价值。但1,25(OH)₂D₃存在高钙血症等严重不良反应风险，有必要降低其不良反应风险以实现更低剂量的治疗应用。

由于1,25(OH)2D₃的生物学活性通过维生素D受体(VDR)介导，而VDR是一种调控细胞分化相关基因表达的核受体，因此实现1,25(OH)₂D₃的细胞内高效递送和核内转运，可能以更低药物剂量获得治疗效果。为此，首先需要实现高效的细胞质递送。研究人员据此关注使用SS-OP脂质纳米粒(SLPs)，SS-OP是一种作为核酸递送载体开发的SS-可断裂、质子激活型类脂材料，该类脂质纳米粒可通过促进内涵体逃逸和细胞摄取后的药物释放来实现细胞质递送。此外，脂质纳米粒中辅助脂质的组成可影响细胞内药物递送过程和组织分布，辅助脂质已知可调节膜融合和内涵体逃逸，从而影响包封化合物的细胞内转运。

本研究中，研究人员系统考察了脂质纳米粒组成差异如何影响1,25(OH)₂D₃的细胞内转运和治疗效果，具体评估了1,25(OH)₂D₃的核转位及其诱导上皮细胞分化的能力，并进一步在肺气肿小鼠模型中考察了基于SS-OP的脂质纳米粒能否在保持治疗效果的同时降低1,25(OH)₂D₃的所需剂量。通过组织学和功能分析评估肺再生情况，并通过血钙水平测量评估高钙血症风险。该策略有望实现1,25(OH)₂D₃的治疗应用，同时将高钙血症等全身性不良反应降至最低。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：通过反溶剂稀释法制备1,25(OH)₂D₃包封的SS-OP脂质纳米粒，利用动态光散射测定粒径和zeta电位，高效液相色谱(HPLC)测定包封率；以ApoE介导的摄取途径考察HeLa细胞的细胞内化；采用共聚焦显微镜结合早期内涵体标记评估内涵体逃逸效率；以钙黄绿素为替代标记物在还原剂二硫苏糖醇(DTT)存在下评估药物释放动力学；通过细胞分级分离和HPLC定量分析1,25(OH)₂D₃的细胞内及核内转运；以小干扰RNA(siRNA)介导VDR敲低并结合蛋白质免疫印迹验证功能机制；以Calu-6细胞为模型，通过免疫荧光检测CD90、AQP-5和SP-A等标志物评估肺细胞分化诱导能力；采用弹性蛋白酶诱导的ICR小鼠COPD模型，经肺给药后通过flexiVent系统测定FEV_0.05%评估呼吸功能，苏木精-伊红(H&E)染色结合ImageJ计算平均线性截距(Lm)评估肺泡结构修复，并长期监测血清Ca²⁺水平评估安全性。

研究结果部分按以下小节展开阐述。

**3.1 1,25(OH)₂D₃包封SLPs的表征**

研究人员测定了1,25(OH)₂D₃包封SLPs的粒径、zeta电位和包封率作为物理性质指标。结果显示，无论使用DOPC还是DOPE作为辅助脂质，制备的纳米粒均呈中性zeta电位，且具有均匀的单峰粒径分布。DOPC辅助的SLPs包封率为40.2%±0.72%，粒径117±5.33 nm，多分散指数0.15±0.02，zeta电位-2.32±0.47 mV；DOPE辅助的SLPs包封率为34.9%±1.32%，粒径121±3.45 nm，多分散指数0.11±0.02，zeta电位-7.31±0.58 mV。两种制剂物理性质相似，为后续细胞内动力学比较提供了基础。

**3.2 细胞内动力学**

**3.2.1 SLPs通过ApoE的细胞内摄取**

脂质纳米粒已知可在表面吸附载脂蛋白E(ApoE)并通过低密度脂蛋白受体(LDLR)内化入细胞。研究人员将两种SLPs暴露于不表达ApoE的HeLa细胞30分钟，发现添加ApoE组的香豆素6荧光强度均显著高于无ApoE组，且DOPE制备的SLPs较DOPC制备的SLPs显示出更高的细胞内摄取。这表明ApoE介导的摄取途径对两种辅助脂质的SLPs均有效，但DOPE辅助的SLPs具有更优的细胞内化效率。

**3.2.2 SLPs的内涵体逃逸能力**

细胞摄取后，SLPs通过其叔胺结构从内涵体中逃逸。研究人员通过共聚焦显微镜比较了两种SLPs的内涵体逃逸能力。DOPC辅助的SLPs显示黄色共定位信号，表明滞留于早期内涵体中；而DOPE辅助的SLPs与早期内涵体的共定位极少，绿色荧光广泛弥漫分布于细胞质中，表明其高效逃逸出早期内涵体。定量分析显示，DOPE辅助的SLPs具有显著更高的内涵体逃逸效率。

**3.2.3 SLPs的药物释放**

为考察二硫键断裂触发的药物释放，研究人员以SS-OP脂质中二硫键被碳链取代的CC-OP脂质制备的纳米粒作为不可断裂对照。在还原剂DTT存在下，SS-OP制备的SLPs释放钙黄绿素，其中DOPE辅助的SLPs较DOPC辅助的SLPs释放更多；而CC-OP制备的SLPs无论有无还原剂均几乎不释放药物。这证实了SS-OP的可还原断裂特性，以及DOPE辅助脂质在促进药物释放方面的优势。

**3.2.4 1,25(OH)₂D₃的核转位量**

为考察1,25(OH)₂D₃向作用位点细胞核的高效递送，研究人员将1,25(OH)₂D₃包封SLPs与ApoE混合后暴露Calu-6细胞60分钟。结果显示，DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs组的核内1,25(OH)₂D₃浓度显著高于游离1,25(OH)₂D₃组和DOPC辅助的SLPs组。

**3.2.5 1,25(OH)₂D₃包封SLPs诱导肺细胞分化**

研究人员以CD90（间充质干细胞标志物，代表未分化肺泡上皮祖细胞）作为未分化标志物，以AQP-5（I型肺泡上皮细胞标志物）和SP-A（II型肺泡上皮细胞标志物）评估向肺泡上皮细胞的分化。结果显示，游离1,25(OH)₂D₃的分化诱导作用仅在1 μM浓度下确认，DOPC辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs未观察到分化诱导，而DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs在0.1 μM即显示分化诱导效果，表明其可在更低剂量下发挥分化诱导作用。

**3.2.6 VDR的参与**

1,25(OH)₂D₃通过细胞核内的VDR发挥作用。研究人员通过siRNA敲低VDR表达至0.3倍，发现VDR敲低使核内1,25(OH)₂D₃浓度降低约60%，且在0.5 μM浓度下的分化诱导能力消失。这提示VDR参与1,25(OH)₂D₃的核转位和分化诱导作用。

**3.3 1,25(OH)₂D₃包封SLPs的肺气肿改善效果**

**3.3.1 呼吸功能的改善**

研究人员以FEV_0.05%作为评估指标，对应人类FEV_1.0%参数。弹性蛋白酶诱导的COPD模型小鼠经肺给药每周两次、持续3周后，游离1,25(OH)₂D₃在1.0 μg/kg剂量显示显著呼吸功能改善；DOPC辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs在0.01和0.1 μg/kg剂量未显示改善；而DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs在0.1 μg/kg剂量即显著改善呼吸功能。使用SLPs可将剂量降至游离1,25(OH)₂D₃的十分之一。

**3.3.2 基于平均线性截距(Lm)的肺泡修复评估**

研究人员对弹性蛋白酶诱导的COPD模型小鼠经肺给药每周两次、持续3周后进行评估。对照组、0.1 μg/kg游离1,25(OH)₂D₃组和DOPE安慰剂SLPs组均显示弹性蛋白酶诱导的肺泡壁破坏和肺泡扩张；而1.0 μg/kg游离1,25(OH)₂D₃组和DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs(0.01和0.1 μg/kg)组的肺泡尺寸较对照组更小。Lm值定量分析显示，1.0 μg/kg游离1,25(OH)₂D₃组和DOPE辅助的SLPs(0.01和0.1 μg/kg)组较对照组显著改善。

**3.4 1,25(OH)₂D₃包封SLPs降低不良反应风险**

研究人员对7周龄雄性ICR小鼠经肺给药每周两次、持续12周，考察血清Ca²⁺浓度变化。游离1,25(OH)₂D₃(0.1、1.0 μg/kg)组显示血清Ca²⁺浓度显著升高，而DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs即使在0.1 μg/kg剂量也未引起血清Ca²⁺浓度升高。

讨论部分，研究人员系统分析了辅助脂质差异影响SLPs细胞内动力学的作用机制。尽管两种辅助脂质的SLPs物理性质相似，但DOPE辅助的SLPs在ApoE介导的细胞摄取、内涵体逃逸、药物释放和核转位方面均表现更优。DOPC和DOPE均为含两个不饱和脂肪酸分子的磷脂，广泛用作脂质纳米粒的组成脂质。ApoE的添加增强了SLPs的细胞摄取，与既往关于ApoE通过脂蛋白受体介导摄取的报道一致。除LDLR外，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)也在肺环境中与ApoE相互作用，LRP1可识别ApoE修饰的脂质纳米粒并介导其细胞摄取，因此LRP1也可能参与SLPs在肺细胞中的摄取。但由于两种SLPs受ApoE影响相似，ApoE不能解释DOPC与DOPE辅助SLPs之间的差异。

PE类脂质如DOPE具有锥形结构，可增加膜曲率、降低膜稳定性，从而产生更高的膜流动性。增加的膜流动性可增强蛋白质吸附，且PE类脂质更易采取倒六角相，促进膜融合和高效的内涵体逃逸。研究人员推测，DOPE辅助的SLPs可能形成倒六角相，使其更易发生膜融合，从而实现更高效的内涵体逃逸。内涵体逃逸和药物释放能力与SS-OP的特性也密切相关：其叔胺在酸性内涵体环境中质子化，二硫键在还原性细胞质中断裂，共同促进内涵体破坏和受控药物释放。

核内1,25(OH)₂D₃转运量评估显示，DOPE辅助的SLPs实现了较游离1,25(OH)₂D₃和DOPC辅助的SLPs更高的核递送效率，且仅在DOPE辅助的SLPs较低剂量下即观察到分化诱导效果。这归因于DOPE辅助的SLPs高效的细胞质递送。VDR敲低也减少了1,25(OH)₂D₃的核转位量和分化诱导能力，提示VDR参与1,25(OH)₂D₃的核转位和分化诱导作用。

体内研究验证了这一发现。与游离1,25(OH)₂D₃相比，DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs在低剂量下即促进肺泡修复和改善呼吸功能。然而，肺泡结构修复所需剂量低于呼吸功能改善所需剂量，提示结构再生 alone 不足以完全恢复功能，可能需要血管生成等额外过程。重要的是，DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs治疗剂量未引起血清Ca²⁺水平升高。DOPE辅助的SLPs增强的细胞内递送和核转位不仅提高了治疗效果，还降低了全身暴露，这可能有助于抑制血清Ca²⁺升高，表明高效的细胞内靶向可同时实现增效减毒。尽管肺给药可直接将药物递送至肺部，但长期肺给药仍有部分药物迁移至体循环导致血钙升高。SLPs增加的肺细胞摄取减少了进入体循环的1,25(OH)₂D₃量，从而降低了不良反应风险。鉴于COPD吸入制剂可能需要长期使用，DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs作为更安全有效的治疗选择具有潜力。研究人员指出未来需测定长期给药期间的血清1,25(OH)₂D₃水平以阐明治疗剂量下的药代动力学特征，并计划进一步验证SLPs制备的干粉吸入剂的临床应用潜力。

研究结论部分翻译如下：本研究中，研究人员证明了包封1,25(OH)₂D₃的SLPs通过使用响应细胞内环境的SS-OP脂质和辅助脂质DOPE，有效促进了维生素D₃的核递送，并进一步揭示了VDR的参与。此外，DOPE辅助的1,25(OH)₂D₃包封SLPs由于可使用更低剂量且表现出降低的不良反应，有望成为COPD的治疗候选药物。