《MedComm》：Bioartificial Livers Developed From Gene-Edited Pig Hepatocyte Organoids Improve Amino Acid and Lipid Profiles in the Plasma of Patients With Liver Failure
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肝衰竭仍然是一种危及生命的综合征，除了移植外，可用的治疗选择极其有限。本研究通过开发一种新型生物人工肝（BAL）系统，解决了关键的细胞来源和机制挑战。研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除了原代猪肝细胞中的GGTA1基因以降低免疫原性。这些肝细胞与过表达R
肝衰竭仍然是一种危及生命的综合征，除了移植外，可用的治疗选择极其有限。本研究通过开发一种新型生物人工肝（BAL）系统，解决了关键的细胞来源和机制挑战。研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除了原代猪肝细胞中的GGTA1基因以降低免疫原性。这些肝细胞与过表达R-spondin1的人脐静脉内皮细胞（R-HUVECs）共培养，形成功能稳定的肝类器官。在使用急性慢性肝衰竭（ACLF）患者血浆的体外研究中，BAL系统表现出卓越的解毒能力，与传统非生物人工肝（NAL）支持相比，显著降低了氨和胆红素水平。多组学分析揭示，BAL治疗通过促进支链氨基酸（BCAA）代谢和上调与膜修复及抗炎信号相关的溶血磷脂酰胆碱（LPC）种类，主动恢复了代谢稳态。重要的是，这项研究表明，与NAL的被动物理过滤不同，BAL充当了全身代谢的主动生物调节器。这些发现为BAL技术的临床转化提供了坚实的理论和实践基础，为通过调节全身代谢改善肝衰竭患者预后提供了一种有前景的策略。
**论文解读文章**
肝衰竭是全球每年约100万人死亡的重要原因，肝移植是终末期患者的最终治疗手段，但受限于供体短缺、高昂费用和手术风险。人工肝支持系统作为桥接疗法，非生物人工肝（NAL）如双重血浆分子吸附系统（DPMAS）虽能清除毒素，却缺乏肝脏的代谢与合成功能；生物人工肝（BAL）利用活体肝细胞提供生物功能，被视为替代方案。然而，BAL的临床转化面临三大瓶颈：异种细胞的免疫原性与病毒传播风险（如猪内源性逆转录病毒）、原代肝细胞体外长期功能维持困难、以及BAL治疗背后的分子机制（尤其代谢调控）尚未系统阐明。研究人员为此开发了新型BAL系统，旨在解决这些根本挑战。
研究人员开展的研究包括：利用CRISPR/Cas9技术敲除GGTA1基因（编码α-1,3-半乳糖基转移酶）以降低猪肝细胞免疫原性，并通过与过表达R-spondin1（RSPO1）的人脐静脉内皮细胞（R-HUVEC）共培养形成功能稳定的肝类器官；收集8例来自四川大学华西医院感染性疾病中心的急性慢性肝衰竭（ACLF）患者血浆，进行序贯治疗（先NAL后BAL），通过生化、炎症因子检测及靶向代谢组学、靶向脂质组学分析，比较两种疗法的疗效与机制。研究结论：BAL系统不仅提供快速解毒，还主动调节全身代谢，促进支链氨基酸代谢和修复性脂质上调，显著优于NAL的被动物理吸附。这项研究发表在《MedComm》，为BAL技术的临床转化提供了坚实的理论和实践基础。
主要关键的技术方法包括：①通过卵管内注射重组腺相关病毒（rAAV）介导的CRISPR/Cas9载体，一步法生成GGTA1基因敲除（GTKO）的巴马迷你猪，获得低免疫原性原代肝细胞；②将肝细胞与RSPO1过表达的HUVEC（R-HUVEC）以50:1比例共培养，在三维摇动系统中形成肝类器官，利用RSPO1激活Wnt/β-catenin信号通路，促进增殖和功能维持；③收集8例ACLF患者（2023年3至6月于华西医院住院）血浆，序贯进行NAL（DPMAS联合血浆置换）和BAL（含肝类器官的中空纤维生物反应器）治疗，收集四个时间点血浆样本；④采用液相色谱-质谱（LC-MS）进行靶向代谢组学和靶向脂质组学分析，结合主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和通路富集分析。
研究结果：
**2.1 卵管内注射rAAV-CRISPR/Cas9生产基因编辑猪**
通过卵管内注射混合rAAV载体，成功获得GGTA1双等位基因敲除猪，免疫荧光证实肝组织中GGTA1蛋白缺失，遗传至后代形成稳定纯合子群体。
**2.2 R-HUVEC共培养肝细胞类器官的形成与功能表征**
与野生型HUVEC或纯肝细胞相比，R-HUVEC共培养组肝类器官在24小时内自组装更致密，H&E和PAS染色显示结构增强和糖原储存能力提高；EdU标记显示增殖活性显著升高；白蛋白（ALB）和尿素合成在28天培养期内持续高水平，肝特异性基因（Alb、Arg1、Cyp1a1、CPS1）表达上调。证实RSPO1过表达的内皮细胞通过激活Wnt/β-catenin信号促进肝细胞成熟、存活和长期功能。
**2.3 ACLF患者序贯NAL和BAL治疗的生化与炎症反应**
8例ACLF患者（6男2女，平均年龄46.8岁，75%为HBV感染）序贯治疗后，BAL较NAL进一步显著降低总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和血氨；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在两种治疗后均显著下降，而白介素-8（IL-8）仅在BAL后显著降低；白介素-10（IL-10）在BAL组呈现上升趋势（p = 0.0593），提示抗炎反应增强。
**2.4 比较代谢组学揭示BAL较NAL增强解毒与氨基酸恢复**
通过靶向代谢组学分析，PCA显示BAL治疗后血浆代谢物沿第一主成分分离最明显；火山图显示BAL引起更广泛的代谢物改变（NAL仅少数差异），差异代谢物富集于氨基酸和胆汁酸代谢通路。分层聚类显示BAL后上调支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）、精氨酸、赖氨酸等氮和能量代谢中间体，下调胆汁酸（甘氨胆酸、牛磺胆酸）和尿毒症毒素（硫酸吲哚酚）；通路富集分析确认BAL影响缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成、甘氨酸/丝氨酸代谢、精氨酸/脯氨酸代谢、初级胆汁酸生物合成及三羧酸（TCA）循环。表明BAL不仅清除毒素，还部分恢复氨基酸和能量代谢。
**2.5 靶向脂质组学揭示BAL与NAL不同的代谢特征**
定量1243种脂质后，PLS-DA显示两组干预均引起血浆脂质组变化但模式不同：NAL改变更多脂质种类但异质性大，包括磷脂酸（PA）、胆固醇酯（CE）及高度不饱和磷脂（PE、PS、PG）的广泛升高；BAL则引起更精确一致的变化，显著上调溶血脂酰胆碱（LPC 18:0、20:4、22:4、22:5）和特定二酰甘油（DAG 18:2/22:6、16:0/22:4），这些脂质与膜重塑、抗炎信号和细胞能量调节密切相关。BAL处理后样本聚类更紧密，表明协调的代谢调整。
讨论部分总结：本研究通过CRISPR/Cas9敲除GGTA1与R-HUVEC共培养策略，解决了原代猪肝细胞的免疫原性和功能维持瓶颈。BAL系统不仅充当解毒工具，更作为主动生物调节器，通过上调LPC等脂质介导抗炎和膜修复，促进BCAA代谢恢复蛋白质合成和能量代谢。与NAL的物理过滤不同，BAL在分子水平主动调节全身代谢，支持肝功能恢复。研究结论翻译如下：总之，本研究证明BAL系统不仅提供快速解毒，还在分子水平主动调节全身代谢以支持肝功能恢复。尽管这些结果代表了显著进展，但大规模临床试验和更深入的机制研究对全面评估该系统在未来临床应用中的安全性和有效性至关重要。
