综合整合的单细胞和空间转录组学揭示槟榔相关口腔黏膜癌变及其肿瘤微环境的动态图谱

《MedComm》：Comprehensive Integrated Single-Cell and Spatial Transcriptomics Unveil the Dynamic Landscape of Betel Nut-Associated Oral Mucosal Carcinogenesis and Its Tumor Microenvironment

槟榔咀嚼是口腔鳞状细胞癌（OSCC）的主要病因因素，但其机制基础仍不明确。在此，研究人员对6名OSCC患者进行了单细胞RNA测序和空间转录组学，以全面剖析与槟榔诱导的口腔黏膜癌变相关的肿瘤微环境（TME）动态和细胞异质性。研究人员鉴定出一个纤维化、免疫抑制性的TME，其特征是癌症相关成纤维细胞（CAFs）和B/浆细胞扩增，同时细胞毒性T/NK细胞和巨噬细胞减少。CAFs，特别是抗原呈递CAFs，在侵袭前沿空间富集并驱动上皮可塑性和恶性转化。值得注意的是，研究人员发现一个恶性上皮亚群LAMC2⁺ EpiC6，富集了上皮-间充质转化（EMT）程序、血管生成和转移相关通路，并与CAFs及其他非恶性成分广泛交互。临床上，LAMC2在槟榔咀嚼者的OSCC组织中显著升高，槟榔碱处理OSCC细胞系可诱导LAMC2上调、EMT及体外迁移和侵袭能力增强。总之，研究人员的成果描绘了上皮细胞进展的恶性轨迹，强调LAMC2⁺ EpiC6是由EMT相关转录调控因子和细胞外基质重塑协调的关键侵袭性亚群。这些发现提供了机制见解，并确定了破坏肿瘤-基质相互作用和减缓疾病进展的潜在治疗靶点。

**论文解读文章**

**研究背景与存在问题**
槟榔咀嚼是全球超过6亿人的习惯，已被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物，是口腔鳞状细胞癌（OSCC）的主要病因。槟榔中的主要生物碱——槟榔碱，可导致口腔黏膜下纤维化（OSF），其恶性转化率高达7.6%。既往研究揭示了槟榔致癌涉及炎症、遗传表观遗传异常及上皮-间充质转化（EMT）等多步骤过程，但肿瘤微环境（TME）中细胞异质性和空间动态在槟榔相关OSCC恶性转化中的作用仍不明确。传统研究多聚焦单一细胞类型或信号通路，缺乏对TME全貌的系统解析。因此，研究人员开展本研究，旨在通过整合单细胞和空间转录组学，绘制槟榔相关OSCC的细胞和分子图谱，揭示TME重塑机制及潜在治疗靶点。

**研究概要**
本研究对6名OSCC患者（3名有槟榔咀嚼史，3名无）的配对肿瘤及邻近正常组织进行单细胞RNA测序和空间转录组学分析，共获得38,814个高质量单细胞和10,559个空间转录组斑点。通过整合分析，研究人员揭示了槟榔相关OSCC中独特的纤维化、免疫抑制性TME，并以LAMC2⁺恶性上皮亚群（EpiC6）为核心，描绘了其经CAF-基质相互作用驱动的恶性转化轨迹。体外实验证实槟榔碱可通过上调LAMC2、诱导EMT增强OSCC细胞迁移和侵袭能力。该研究发表在《MedComm》。

**关键技术方法**
主要关键技术方法包括：使用10x Genomics平台对FFPE组织进行单细胞RNA测序（GEM-X Flex）和空间转录组学（Visium CytAssist）；运用Seurat进行数据整合及聚类，Monocle2进行拟时序分析，CellChat推断细胞间通信；通过多重免疫组化（mIHC）验证空间共定位；OSCC细胞系（SCC9、SCC25）经槟榔碱处理进行功能验证。样本来源于中山大学附属第一医院口腔颌面外科。

**研究结果**

**2.1 动态单细胞和空间转录组图谱**
通过整合scRNA-seq和空间转录组数据，比较槟榔咀嚼组与非咀嚼组的细胞组成变化。结果发现，槟榔相关OSCC的TME中，基质细胞（CAF和内皮细胞）及B/浆细胞比例升高，而巨噬细胞和T/NK细胞比例降低，呈现免疫抑制和纤维化特征。空间转录组进一步显示CAFs在侵袭前沿富集。

**2.2 鉴定一个高侵袭性LAMC2⁺恶性上皮亚群**
对上皮细胞进行亚聚类分析，鉴定出8个亚群（EpiC1-8）。其中EpiC6（高表达LAMC2、MMP9、SERPINE1）在槟榔相关肿瘤中显著扩增，富集EMT、血管生成和转移相关基因程序。拟时序分析显示EpiC6位于分化轨迹末端，并伴随细胞外基质重塑相关通路的激活。转录因子（TF）活性分析揭示SNAI1、RUNX2、SMAD4等EMT相关TFs在EpiC6中高活性。空间和免疫组化验证LAMC2在槟榔咀嚼者肿瘤中高表达，且高表达组总体生存率更差。

**2.3 基质细胞异质性与功能动态**
CAFs被分为三个亚群：抗原呈递CAF（apCAF，CD74⁺）、肌成纤维细胞CAF（myCAF，COL5A1⁺）和炎症性CAF（iCAF，PDGFRA⁺）。槟榔相关肿瘤中apCAF比例升高，且富集于侵袭前沿与LAMC2⁺上皮细胞相邻。内皮细胞中，淋巴内皮细胞（C11）在槟榔相关OSCC中扩增，表达淋巴管生成相关基因（FLT4、PROX1），可能促进淋巴转移。

**2.4 免疫细胞异质性与功能多样性**
巨噬细胞分为三个亚群：C16（C1QC⁺）、C17（COTL1⁺）和C18（SPP1⁺）。C18巨噬细胞呈M2型极化，高表达糖酵解基因和促血管生成因子（MMP9、VEGFB），且在肿瘤中富集。DC细胞中，浆细胞样DC（pDC）在槟榔相关肿瘤中扩增。B/浆细胞分为五个亚群，其中B_IGHG1（C25）在肿瘤中扩增，而浆细胞（C29）比例下降。

**2.5 细胞间通信揭示肿瘤上皮-CAF交互驱动恶性转化**
通过CellChat分析，发现恶性上皮细胞（尤其EpiC6）与CAFs、巨噬细胞间存在广泛信号交互。关键配体-受体对包括胶原蛋白（COL1A1、COL4A1）与整合素（ITGA2+ITGB1、CD44）以及层粘连蛋白（LAMA2、LAMB1）与整合素的相互作用。mIHC验证了LAMC2⁺上皮细胞、CD74⁺ apCAFs和SPP1⁺巨噬细胞在槟榔相关肿瘤的空间共定位。

**2.6 槟榔碱增强OSCC细胞迁移侵袭能力**
对114例OSCC临床标本（槟榔咀嚼者45例，非咀嚼者69例）进行免疫组化分析，证实槟榔咀嚼者肿瘤中LAMC2表达显著升高。体外实验显示，槟榔碱处理SCC9和SCC25细胞后，LAMC2蛋白上调，E-钙黏蛋白（E-cadherin）下调，N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）上调，且迁移和侵袭能力增强。

**讨论与结论**
本研究通过整合多组学方法，系统揭示了槟榔相关OSCC中由CAF扩增、代谢适应性巨噬细胞、失调的B细胞免疫以及上皮-基质通讯塑造的免疫抑制和基质增强的TME。这些发现为理解槟榔致癌的微环境重塑提供了机制框架，并指出LAMC2、CAF亚群及相关信号轴（如胶原-整合素）可作为潜在治疗靶点。研究结论翻译如下：总之，研究人员的研究揭示了槟榔相关OSCC中独特的免疫抑制和基质增强的TME，其由CAF扩增、代谢适应性巨噬细胞、失调的B细胞免疫以及上皮-基质通讯塑造。这种整合多组学方法与功能研究可能发现新的生物标志物和治疗靶点，满足这一高危人群有效干预的未满足临床需求。