靶向的、受体介导的遮蔽型D-氨基酸细胞穿透肽递送用于细胞特异性光毒性

《The FEBS Journal》：Targeted, receptor-mediated delivery of a masked d-amino acid cell-penetrating peptide for cell-specific phototoxicity

光动力疗法（PDT）是一种创新的癌症治疗选择，但当前方法受到肿瘤选择性差和摄取率低的限制。研究人员引入了一种靶向光毒性肽的新概念，其中一种溶酶体可激活的有效载荷通过受体介导的内吞（endocytosis）被选择性递送到细胞中。对于光毒性有效载荷，将6-羧基四甲基罗丹明（TMR）连接到细胞穿透肽（CPP）上，该肽在内化到内体（endosome）后特异性激活。CPP的活性通过与多聚谷氨酸（poly-glutamate）序列的静电相互作用被阻断，但可以通过溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B（cathepsin B）的切割恢复，无论是在体外还是在细胞中。去遮蔽的CPP结合到带负电荷的溶酶体膜上，在照射时，TMR产生活性氧（ROS），破坏膜的完整性。这导致溶酶体内容物释放到细胞质中，随后诱导细胞死亡。为了实现靶向递送，研究人员还将可激活的有效载荷与chemerin-9（一种化学因子样受体1（CMKLR1）的高亲和力配体）结合，CMKLR1是一种在多种癌症中过表达的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor）。通过这种受体靶向方法，肽仅累积在表达CMKLR1的细胞中，而溶酶体激活完全防止了脱靶毒性。值得注意的是，这种策略使得像TMR这样的弱光敏剂（photosensitizer）通过溶酶体靶向实现了有效的细胞毒性。因此，这种方法代表了PDT选择性和有效性的进步，并有望开发新的癌症疗法。

**论文解读文章**

**研究背景、问题与目的**

光动力疗法（PDT）是一种利用光敏剂在光照下产生活性氧（ROS）以杀伤肿瘤细胞的癌症治疗手段，但其临床应用受限于肿瘤组织选择性差和瘤内积累不足。为提高选择性，研究人员尝试将光敏剂与肿瘤过表达受体的配体结合，通过受体介导的内吞实现靶向递送。化学因子样受体1（CMKLR1）是一种在肺癌、前列腺癌和结直肠癌等多种癌症中过表达的G蛋白偶联受体，其高亲和力配体chemerin-9已被证明可有效递送小分子药物。然而，现有光敏剂在递送后常被困于内体/溶酶体，导致光毒性效率低下。为解决这一问题，本研究设计了一种新型靶向光毒性肽，将遮蔽型细胞穿透肽（CPP）与chemerin-9偶联，以在受体介导内吞后于溶酶体中被组织蛋白酶B特异性激活，进而通过光化学内化（PCI）诱导靶细胞死亡。该研究论文发表在《The FEBS Journal》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用固相肽合成（Fmoc/tBu策略）方法合成了所有肽，并通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）和电喷雾电离轨道阱质谱（ESI-Orbitrap MS）表征其纯度（>95%）与身份。活性评估通过Ca²⁺ flux实验（使用稳定表达CMKLR1和嵌合G蛋白Δ6Gαqi4myr的COS-7细胞）测定EC₅₀。细胞摄取与定位通过荧光显微镜观察（HEK293、稳定转染HEK293_CMKLR1-eYFP及内源性表达CMKLR1的HMEC-1细胞）。肽的稳定性通过重组组织蛋白酶B体外消化及细胞裂解物分析，结合RP-HPLC与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）检测裂解产物。光化学内化（PCI）实验在显微镜下以565 nm或640 nm照射后进行实时成像。光毒性通过高内涵成像系统（HCI）进行系统性照射，并用刃天青（resazurin）法检测细胞活力。

**研究结果**

**1. 肽合成与表征**
通过固相肽合成成功制备了6种肽（表1），包括靶向肽（5：TMR-r9-e9-Chem9）及其对照肽。所有肽纯度均>95%，经双柱RP-HPLC验证。

**2. CMKLR1介导的细胞摄取**
Ca²⁺ flux实验显示，L-氨基酸肽4（TMR-R9-E9-Chem9）和D-氨基酸肽5（TMR-r9-e9-Chem9）均以纳摩尔活性激活CMKLR1（EC₅₀分别为30.3 nM和26.6 nM）。荧光显微镜观察到，未遮蔽的肽3（TMR-r9）在HEK293及HEK293_CMKLR1-eYFP细胞中均呈点状荧光（非特异性内吞），而靶向肽4和5仅内化于表达CMKLR1的细胞，且与CMKLR1共定位，证实受体介导的摄取及多聚谷氨酸遮蔽防止了非特异性内吞。

**3. 肽稳定性与细胞内释放**
体外组织蛋白酶B消化实验显示，L-肽4在24 h后降解为小片段（如TMR-RR-OH），而D-肽5主要生成完整的TMR标记非a-D-精氨酸片段（TMR-rrrrrrrrrE-OH）。细胞内稳定性实验（HEK293_CMKLR1-eYFP细胞裂解物）中，L-肽4快速降解为单个TMR-精氨酸（TMR-R-OH），而D-肽5的裂解产物与体外一致（TMR-rrrrrrrrrE-OH），4 h后几乎无完整肽残留，表明D-氨基酸构型赋予抗蛋白酶降解能力。

**4. 光化学内化（PCI）**
在HEK293_CMKLR1-eYFP细胞中孵育6 h后，以565 nm照射10 s，L-肽4未引起胞质分布，而D-肽5迅速出现光诱导的内体/溶酶体破裂，形成荧光“羽流”弥散至胞质（延时成像证实）。进一步实验表明，未遮蔽的肽3在30 min孵育后即可引发PCI，而遮蔽的肽5需要更长时间（6 h）以允许溶酶体释放活性CPP。使用Cy5标记（低单线态氧产率）的对照肽6和7未观察到PCI，证明ROS是PCI的驱动因素。

**5. 光毒性**
以高内涵成像系统对HEK293、HEK293_CMKLR1-eYFP及HMEC-1细胞进行系统性照射（565 nm，3 s/点）。未照射时，未遮蔽肽3在31.6 μM浓度下显示轻微毒性，而遮蔽肽4和5在所有细胞中耐受良好。照射后，肽3在所有细胞系中均呈毒性（1 μM即有效），肽2（无CPP）和L-肽4无光毒性。D-肽5仅对表达CMKLR1的细胞（HEK293_CMKLR1-eYFP和HMEC-1）显示选择性光毒性（最大细胞活力降低约30%），对无受体的HEK293无影响。其较低效力可能归因于受体介导摄取量低于CPP非特异性摄取，以及裂解产物中残留的谷氨酸削弱了膜结合能力。

**总结与讨论**

本研究成功设计并合成了受体特异性光毒性肽，通过chemerin-9靶向CMKLR1，将TMR标记的非a-D-精氨酸（r9）选择性递送至表达CMKLR1的细胞。多聚谷氨酸遮蔽序列防止了非特异性摄取，而组织蛋白酶B可裂解接头实现了溶酶体激活释放。稳定性数据证实了细胞内数小时内完成裂解。照射后，内化的肽诱导内体/溶酶体破裂，导致快速细胞死亡（在稳定转染的HEK293_CMKLR1-eYFP和HMEC-1细胞中），而在无CMKLR1的细胞中无毒性。利用弱光敏剂TMR实现受体选择性光毒性，提示可应用更强效光敏剂开发高靶向性的PDT肽。此外，结合受体介导内吞肽与可溶酶体选择性释放的遮蔽CPP，为其他靶向细胞内靶点的细胞特异性载荷递送开辟了新途径。

**结论部分翻译：**
总之，研究人员设计并合成了受体特异性光毒性肽，这些肽选择性地将TMR标记的非a-D-精氨酸递送到表达CMKLR1的细胞中。有效载荷通过多聚谷氨酸序列的静电遮蔽防止了进入无受体的细胞。使用组织蛋白酶B可裂解的接头实现在内体途径中的选择性释放，稳定性数据表明在体外和细胞培养中均能在数小时内成功切割。内化肽的照射诱导内体/溶酶体破裂，导致稳定转染的HEK293_CMKLR1-eYFP和HMEC-1细胞快速死亡，而在无CMKLR1的细胞中未观察到毒性。使用像TMR这样的弱光敏剂实现受体选择性光毒性表明有机会将这种方法与更强效的光敏剂结合，以开发用于PDT的靶向高效肽。此外，这种将用于受体介导内吞的肽与可在内体中选择性释放的遮蔽CPP相结合的方法，可能为其他具有细胞内靶点的细胞特异性载荷开辟了道路。