聚磷酸盐（Polyphosphates）减弱嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）感染巨噬细胞时白细胞介素-12（IL-12）的产生

《The FASEB Journal》：Polyphosphates Attenuate Interleukin-12 Production in Macrophages Infected With Legionella pneumophila

　　

摘要：聚磷酸盐（Polyphosphates，PolyP）是进化上保守的磷酸残基线性链，存在于所有活细胞中。细菌在胁迫和饥饿条件下积累PolyP用于能量和磷酸盐储存、蛋白质折叠及胁迫适应。感染期间细菌释放的PolyP可能损害宿主应答，但具体机制尚不清楚。本研究发现，军团菌病（Legionnaires' disease）患者支气管肺泡灌洗液（BALF）、单独培养的嗜肺军团菌（Legionella pneumophila，L.p.）及C57BL/6J小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）感染L.p.过程中PolyP均升高。研究人员对感染L.p.并共孵育长链细菌型PolyP或未加PolyP的BMDM进行RNA测序，在近500个差异表达基因中，Il12b（p40）在高表达基因中受抑最显著。长链PolyP（~Pi700）剂量依赖性降低IL-12p40蛋白释放，而短链哺乳动物型PolyP（~Pi70）无此作用，表明细菌特异性靶向固有免疫信号。相反，经炎症小体激活加工且与IL-12功能协同的IL-18未被持续抑制。PolyP主要抑制LPS/TLR4信号，L.p.诱导的IL-12依赖MyD88途径而非TRIF。先前被认为参与PolyP生物学的RAGE和P2Y1并非IL-12抑制所必需。但PI3K/AKT信号介导PolyP效应，可被PI3K抑制剂LY294002、copanlisib和eganelisib逆转。此外，长链PolyP也抑制人单核细胞来源巨噬细胞暴露于L.p.或LPS时的IL-12释放。综上，本研究发现长链细菌PolyP选择性抑制IL-12，提示其作为细菌效应分子可抑制保护性固有免疫应答。

论文解读：长链聚磷酸盐通过PI3K/AKT通路选择性抑制嗜肺军团菌感染巨噬细胞中IL-12的产生

本文发表于The FASEB Journal。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila，L.p.）是引起军团菌病（Legionnaires' disease）的胞内致病菌，通过Dot/Icm IV型分泌系统（Type IV Secretion System，T4SS）向宿主胞质递送效应蛋白以逃逸吞噬并抑制免疫。聚磷酸盐（Polyphosphates，PolyP）是由磷酸根（P_i）经高能磷酸酐键连接的无机生物聚合物，细菌型长链PolyP（≥150 P_i，典型~P_i700）与哺乳动物短链PolyP（~30–120 P_i）功能不同，其在感染中的免疫调节机制不明。已知IL-12（由p35/Il12a与p40/Il12b亚基组成异二聚体）是巨噬细胞响应胞内菌的关键细胞因子，可诱导Th1分化和IFN-γ（干扰素γ）产生，L.p.效应分子可下调IL-12助其存活，但PolyP是否参与此过程尚未阐明。本研究假设L.p.释放的长链PolyP通过调控巨噬细胞细胞因子应答促进感染建立，旨在明确PolyP在L.p.感染中对IL-12的调控作用及机制。

主要关键技术方法

研究人员收集16例确诊军团菌病患者及12例健康人支气管肺泡灌洗液（BALF），以及C57BL/6J小鼠经鼻感染L.p.（1×10⁶CFU）48 h后BALF检测PolyP含量；分离培养C57BL/6J及基因敲除小鼠（Myd88^?/?、Trif^?/?、Casp1^?/?、Casp11^?/?、Ifnγ^?/?、Nod2^?/?、Rage^?/?、P2y1^?/?）骨髓来源巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages，BMDM）及健康人外周血单核细胞来源巨噬细胞（Monocyte-Derived Macrophages，MDM），以MOI 1（BMDM）或5（MDM）感染L.p. JR32株并共处理长链（~P_i700）/短链（~P_i70）PolyP；进行Bulk RNA测序（n=4）及差异表达分析（DESeq2）、KEGG与GSEA富集；采用RT-qPCR检测Il12a、Il12b mRNA；ELISA检测IL-12p40、IL-1β、IL-18、CXCL4（PF4）；磷流式细胞术（Phospho-flow Cytometry）检测AKT^S473磷酸化；使用PI3K抑制剂（LY294002、Copanlisib、Eganelisib）及碱性磷酸酶消化PolyP进行功能验证。

研究结果

3.1 Legionellosis Is Characterized by the Release of Polyphosphates

研究人员检测发现军团菌病患者BALF中PolyP显著高于健康对照；小鼠L.p.感染后肺BALF及L.p.感染BMDM上清PolyP亦升高；L.p.于酸性缺营养液体培养基中PolyP合成显著增加。证实L.p.感染过程中细菌源长链PolyP释放增多。

3.2 Polyphosphates Induce Transcriptome-Wide Changes in Macrophages During Legionella Infection

BMDM经L.p.±长链PolyP刺激10 h后RNA测序显示，L.p.+PolyP vs L.p.单独约500个差异表达基因，Il12b（p40）下调最显著（>60%）且表达量高；Il12rb1、Tyk2、Il27、Stat1、Stat3亦下调。KEGG与IPA富集提示JAK–STAT信号、抗原加工提呈及IL-12信号通路受抑。表明长链PolyP在转录水平选择性抑制IL-12家族基因。

3.3 Polyphosphates Constrain IL-12 Release From Macrophages During Legionella Infection

qPCR与ELISA验证L.p.感染下长链PolyP显著降低Il12b mRNA及IL-12p40蛋白分泌，呈剂量依赖性；LPS（TLR4配体）共刺激亦被抑制，几乎完全抑制高浓度PolyP组；短链PolyP无作用；碱性磷酸酶消化PolyP后抑制解除；L.p.胞内复制及巨噬细胞活力不受影响。表明抑制具长链特异性且仅针对IL-12p40分泌。

3.4 The MyD88 Pathway is the Principal Driver of IL-12 Production in Macrophages Exposed to L. pneumophila

Myd88^?/?BMDM感染L.p.后IL-12p40完全不诱导，Trif^?/?、Nod2^?/?、Ifnγ^?/?、Casp1^?/?无影响（Casp11^?/?略降但非重点）。同时长链PolyP不影响L.p.诱导的IL-1β与IL-18释放。说明IL-12由MyD88依赖途径诱导，PolyP选择性抑制MyD88下游IL-12而不影响炎症小体来源细胞因子。

3.5 Long-Chain Polyphosphates Attenuate LPS-Mediated IL-12 Release by Macrophages

长链PolyP仅抑制TLR4（LPS）诱导的IL-12p40，不抑制TLR2（酵母聚糖/肽聚糖）、TLR5（鞭毛蛋白）、TLR9（dsDNA）诱导者。Rage^?/?与P2y1^?/?BMDM中PolyP对IL-12的抑制依然存在。表明PolyP靶向LPS/TLR4–MyD88轴，且不通过RAGE或P2Y1受体介导。

3.6 The PI3K/AKT Pathway Enables IL-12 Suppression by Long-Chain Polyphosphates

磷流式显示长链PolyP及LPS+PolyP增强AKT^S473磷酸化；广谱PI3K抑制剂LY294002及亚型特异抑制剂Copanlisib（PI3Kα/δ）、Eganelisib（PI3Kγ）均可逆转PolyP对IL-12p40的抑制；RNA-seq中PI3Kγ（Pik3cg）在感染中诱导最强。表明PolyP通过上调PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B）抑制性信号压制IL-12。

3.7 IL-12 Is Suppressed by Long-Chain Polyphosphates in Primary Human Macrophages

人MDM经L.p.或LPS刺激时长链PolyP（非短链）显著抑制IL-12p40释放，表型与小鼠BMDM一致，证实跨种属保守性。

讨论与结论

讨论指出本研究首次证明L.p.释放的长链PolyP在L.p.感染中通过增强PI3K/AKT信号选择性抑制MyD88依赖的IL-12（Il12b/p40）转录与蛋白分泌，且不影响IL-1β与IL-18；PolyP–TLR4/MyD88–PI3K/AKT为关键靶点；RAGE与P2Y1非必需；表型在人原代巨噬细胞重现。局限性包括未使用Δppk突变株直接证明菌源PolyP作用、临床样本未能分辨链长。PolyP此前已被报道抑制吞噬、I型干扰素及STAT1，本研究新增其对Th1极化关键细胞因子IL-12的抑制，支持长链细菌PolyP作为毒力相关效应分子协助L.p.逃逸固有免疫。靶向ppk（多聚磷酸盐激酶，polyphosphate kinase）或PolyP–宿主互作或为抗军团菌感染潜在策略。

研究结论（翻译）：本研究证明长链聚磷酸盐（Polyphosphates）破坏嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）感染期间巨噬细胞介导的正常宿主免疫应答。通过RNA测序及下游验证实验确定，长链PolyP经由抑制性PI3K/AKT通路抑制巨噬细胞中MyD88依赖的IL-12诱导。这些发现支持嗜肺军团菌产生的长链PolyP作为潜在致病驱动因子，通过改变宿主巨噬细胞应答发挥作用。