通过瞬时AND门报告基因筛选携带预期功能性编辑的人造血干细胞——基于人工转录激活子筛选（SMArT）

《Nature Biotechnology》：Selection of human hematopoietic stem cells bearing the intended functional edit by transient AND-gate reporters

　　

利用同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）将基因大小的外源DNA序列定点整合至造血干/祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPCs）用于治疗遗传性疾病时，受到HDR效率低下及编辑位点频发非预期遗传改变的制约。本研究提出一种通过人工转录激活子进行筛选（Selection by Means of Artificial Transactivators, SMArT）的策略，其瞬时实现AND报告基因门控以富集靶位点功能盒式模板整合的细胞。经瞬时筛选子（selector）表达，HDR编辑的HSPCs被富集至80–100%纯度，而携带非预期及潜在基因毒性（genotoxic）靶向编辑的细胞被优先去除。将SMArT富集的HSPCs异种移植至免疫缺陷小鼠后，产生完全HDR编辑的人源移植物，且筛选子在受体内不可检出。SMArT策略采用临床合规的制备工艺与筛选子，支持安全港（safe harbor）位点整合与基因矫正，可保留生理性转录调控，并可跨位点移植甚至配合多功能编辑器（polyfunctional editors）使用。综上，SMArT策略有望拓展基因大小序列编辑的治疗适用性，同时降低其基因毒性负荷。

《通过瞬时AND门报告基因筛选携带预期功能性编辑的人造血干细胞——基于人工转录激活子筛选（SMArT）策略的研究解读》

研究背景与立项依据：

靶向基因组整合基因大小DNA盒至造血干/祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPCs）可通过同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）实现遗传病致病位点的修正或新功能引入。然而，HDR仅限于S/G2期，在慢周期长期重建HSPCs中效率极低；此外，CRISPR-Cas等核酸酶产生的DNA双链断裂（Double-Strand Break, DSB）经非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）或微同源介导末端连接（Microhomology-Mediated End Joining, MMEJ）修复会产生插入/缺失（indels），甚至引发大片段缺失、染色体易位、染色质碎裂（chromothripsis）及模板随机整合等潜在基因毒性（genotoxic）事件。现有HDR编辑产物为遗传异质性混合群体，含无效及风险细胞，限制了临床转化。本研究旨在开发一种能外泌（ex vivo）富集HDR正确编辑HSPCs、同步清除非预期on-target不良事件且无永久筛选子残留的新策略。

主要关键技术方法：

研究人员设计三种SMArT（Selection by Means of Artificial Transactivators）配置，将筛选子（selector，如GFP、ΔLNGFR、tEGFR、CXCR4）嵌入AAV6递送的HDR供体模板，共电转Cas9 RNP与人工转录激活子（Artificial Transactivator, ArT，包括tTA、TALE-VPR、dCas9-VPR、Cas9-VPR）mRNA至预刺激的人脐带血（Cord Blood, CB）或动员外周血（mobilized Peripheral Blood, mPB）来源CD34⁺HSPCs，AAV6转导后加/不加强力霉素（doxycycline）调控。通过流式分选selector⁺细胞，digital droplet PCR（ddPCR）检测HDR等位基因频率及大缺失，纳米孔长读长测序（Nanopore long-read sequencing）分析靶点完整性，集落形成单位（Colony-Forming Unit, CFU）克隆水平基因型鉴定，人工胸腺类器官（Artificial Thymic Organoid, ATO）评估T细胞分化，NBSGW/NSG小鼠异种移植（xenotransplantation）评估体内重建与编辑保真度。

研究结果：

SMArT-1 enriches HDR-edited cells（SMArT-1富集HDR编辑细胞）：

SMArT-1设计中HDR模板含反向独立selector盒（minP-TetO₇-selector），与瞬时共递送的四环素反式激活子（tetracycline transactivator, tTA）mRNA构成AND门，加用doxycycline抑制游离模板本底表达。研究人员在IL2RG与CD40LG位点编辑CB/mPB HSPCs及T细胞，证实selector⁺分选可将HDR编辑纯度提升至近饱和（~100%），selector表达随tTA降解消失，且不干扰内源基因（如IL2RG、CD40LG）生理表达及邻近基因（FOXO4、MED12、LNC00892、ARHGEF6）。该策略可换用临床兼容selector（ΔLNGFR、tEGFR、CXCR4）。

SMArT-2 enriches functionally edited HSPCs, purging out unintended on-target events（SMArT-2富集功能性编辑HSPCs并清除非预期on-target事件）：

SMArT-2将selector通过2A/IRES偶联治疗cDNA，受靶基因（如IL2RG）内源启动子调控，需共递送靶向该启动子的ArT（TALE-VPR或dCas9-VPR）短暂过表达以诱导selector detectable信号。研究人员在男性IL2RG（X连锁单拷贝）编辑中发现，ΔLNGFR⁺分选使HDR克隆比例从55%升至97%，且完全清除含IL2RG启动子大缺失（常波及上游MED12）的克隆；ATO中可分化为功能性T/B淋巴细胞，NBSGW小鼠移植显示富集组移植物HDR效率显著升高，selector随内源调控不持续表达，保留了HSPC多系分化潜能。

SMArT-3 enriches HDR-edited HSPCs at the AAVS1 locus with transient selector expression（SMArT-3通过瞬时selector表达对AAVS1安全港位点HDR编辑HSPCs进行富集）：

SMArT-3 HDR模板含minP（mCMV或低本底SK promoter）驱动独立selector，ArT（TALE-VPR或dCas9-VPR）结合同源臂外基因组序列特异性激活已整合模板中selector。研究人员在AAVS1安全港位点编辑mPB HSPCs，经T7-VPR（TALE7-VPR）或dCas9-VPR+truncated gRNA（tgRNA，防DSB）激活，GFP⁺分选使单/双等位HDR克隆达97–100%，大缺失克隆减少；优化培养（GMP培养基、Maxcyte电转、低MOI AAV6、临床兼容分选）后CD90^high亚群GFP⁺达29%，NSG小鼠移植显示完全HDR编辑移植物、无selector残留、长期重建能力与未分选相当。

Xenografts of SMArT-3 selected HSPCs are fully edited without permanent selector expression（SMArT-3分选HSPCs异种移植呈完全编辑且无永久selector表达）：

如上SMArT-3优化条件移植结果显示，分选组人CD45⁺移植物中HDR等位基因/二倍体基因组均值≈1，selector（GFP）在骨髓、脾脏、外周血均不可检，证明瞬时AND门策略可获得全HDR编辑且无筛选子遗留的安全终产品。

SMArT-3 can be simplified, multiplexed and ported to other loci（SMArT-3可简化、多重化并移植至其他位点）：

研究人员用单Cas9-VPR多功能编辑器（polyfunctional editor）配合全长gRNA切割与截断gRNA（tgRNA，≤16 nt无indel）结合同源臂外/内源基因（CXCR4）启动子区，实现AAVS1位点HDR selector激活与内源CXCR4瞬时上调（协同增效），同样适配IL2RG SMArT-3型供体。证明单一蛋白即可完成切割、HDR模板整合与多位点转录激活，具备跨基因（RAG1亦验证）与多重化潜力。

讨论部分结论翻译：

本研究建立了SMArT——一种通过瞬时合成AND门，将selector表达限定于靶位点正确功能盒整合事件的HSPCs筛选策略，可富集HDR编辑产物、降低基因毒性负荷并维持良好体内重建。SMArT-1通用性强、易操作；SMArT-2适用于具低本底表达且单等位（如X连锁IL2RG）的基因矫正，可彻底清除跨越ArT结合域的大缺失；SMArT-3最灵活，借助外源minP与可移植ArT（尤Cas9-VPR+tgRNA）适配安全港与基因矫正，selector随ArT降解沉默。三种策略均可临床合规化，AAV6 cargo可容纳多数治疗cDNA，亦可换用整合缺陷慢病毒载体（Integrase Defective Lentiviral Vector, IDLV）或适配PASTE/CAST等非HDR定点整合技术。筛选可能缩减克隆多样性，但通过优化培养、动员采集及条形码追踪可缓解。SMArT与新型非清髓预处理联用有望拓宽HSPC基因编辑治疗的Risk-Benefit比。