小鼠胚胎从2细胞阶段至出生的发育时序图谱

《Nature Cell Biology》：Developmental chronology of mouse embryo from 2-cell stage through birth

　　

小鼠发育细胞与谱系图谱（mouse developmental Cell and Lineage Atlas, mdCLA）涵盖了从2细胞阶段（E1.5）至出生（E19.0）的37个时间点的完整胚胎发育过程，共包含200万个细胞，每个细胞中位检测到4,500个基因。该图谱在时间覆盖度和数据质量方面超越了现有的小鼠胚胎图谱，能够精准识别器官特异性细胞类型及其基因表达特征。研究人员利用mdCLA揭示了早期与晚期后肾祖细胞群之间差异显著的基因表达谱，晚期细胞群中上皮分化及免疫应答通路显著上调。此外，通过追踪新生成细胞类型的时间动态，研究人员发现E14.5后存在一种上皮特异性的加速分化过程。研究还对晚期发育阶段上调的转录因子进行了功能验证，其中垂体上皮中Tub基因的特异性敲除导致卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）产生细胞群减少，进而引发小鼠出生后肥胖表型。综上，mdCLA为理解哺乳动物胚胎发育的动态过程及分子机制提供了高质量、全面的参考资源。

哺乳动物受精卵如何发育为完整个体是发育生物学（developmental biology）的核心科学问题。解答这一问题需要全面理解谱系关系、转录调控网络以及不同细胞类型的时空动态特征。单细胞测序（single-cell sequencing）技术的出现使得以高分辨率整合胚胎发育知识成为可能。目前，研究人员已利用多种技术构建了涵盖小鼠胚胎植入前（pre-implantation）、原肠胚形成（gastrulation）、器官发生（organogenesis）及胎儿发育等阶段的单细胞图谱。然而，不同技术在时间覆盖度和数据质量上的差异阻碍了来自不同来源的数据集整合进行荟萃分析，导致发育连续性的理解仍存在显著空白。为填补这一缺口，研究人员建立了涵盖从E1.5至E19.0全部发育时间点的综合性单细胞图谱。

该研究采用标准化的10x Chromium v3平台，对351个胚胎的223.09万个细胞进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），平均每个细胞获得约6.2万条读数，中位检测到4,512个基因和16,910个唯一分子标识符（unique molecular identifier, UMI），显著优于近期发表的同类图谱。为保证数据质量，研究人员采用新鲜细胞进行测序，避免了冷冻-解冻操作导致的应激相关基因表达和mRNA降解。细胞经手工注释整合转录组特征和文献标志物，建立包含6个 level-1 群体、108个器官/组织（level-2）、305个细胞类型（level-3）和1,316个细胞亚型（level-4）的四级分类系统。

研究首先验证了mdCLA在细胞类型鉴定方面的优势。与近期发表的基于单细胞组合索引测序（single-cell combinatorial indexing RNA sequencing, sci-RNA-seq3）的Qiu2024图谱相比，尽管后者细胞数量约为mdCLA的五倍，但mdCLA的深层转录覆盖在细胞亚型和标志物鉴定方面具有独特优势。具体而言，mdCLA成功鉴定了Qiu2024中因表达水平过低而无法明确界定的皮肤神经内分泌细胞（Merkel细胞），并在13种上皮组织中发现了更多的差异表达转录因子共表达模块。

在肾元祖细胞（nephron progenitor cells, NPCs）异质性分析中，研究人员鉴定出6个NPC亚群。RNA速度（RNA velocity）分析揭示所有NPC亚群均起源于E10-11的短暂性群体NPC1，该群体特征性表达转录因子Six1。晚期群体NPC6于E16.0后出现，富集与上皮细胞迁移、分化及免疫应答相关的基因。空间转录组分析进一步证实，E18.0的NPC微环境中上皮分化和免疫应答通路显著上调，提示NPC异质性与阶段特异性微环境信号密切相关。

研究还揭示了上皮细胞系在E14.5后的加速分化现象。通过计算各细胞谱系新亚型数量的累积动态，发现神经、间充质和造血谱系在E11.0-14.0快速多样化并于E13.0后减速，而上皮细胞则在E14.5-17.5出现显著的亚型扩展。Palantir算法量化的分化潜能（differentiation potential, DP）分析证实，多数上皮细胞类型在此期间的DP迅速下降，表明命运分支事件高度集中。分子机制上，该时期上调的基因与器官特异性功能密切相关，如肺上皮细胞的表面活性物质稳态和垂体上皮细胞的肽类激素分泌。

为探索晚期上皮分化的功能调控，研究人员聚焦垂体特异性上调的转录因子Tub。通过Lhx3-iCre驱动的条件性基因敲除策略，在垂体上皮特异性敲除Tub。单细胞测序和免疫荧光分析显示，E18.5 T ub条件敲除（conditional knockout, cKO）胚胎的垂体前叶减小，卵泡刺激素β（FSHβ）阳性细胞显著减少。出生后追踪表明，Tub-cKO小鼠前叶尺寸减小更为明显，并呈进行性体重增加，于2月龄时出现肥胖表型。这一发现揭示了Tub在垂体上皮成熟和激素产生细胞分化中的关键作用，也为Tub缺陷小鼠的肥胖表型提供了崭新的解释线索。

该论文发表于《Nature Cell Biology》，其重要意义在于建立了目前时间覆盖度最广、转录深度最高的小鼠胚胎发育单细胞参考图谱，系统揭示了发育过程中细胞谱系分化的动态规律，特别是发现上皮细胞晚期加速分化的新现象，并通过功能验证阐明了Tub在垂体发育中的关键调控作用。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：基于10x Genomics平台的单细胞转录组测序；基于FIt-SNE和UMAP的降维可视化；结合文献标志物的分级细胞注释策略；基于随机森林的分类器构建与跨数据集标签映射；基于RNA速度和Palantir算法的分化轨迹分析；基于最优传输（optimal transport）算法的谱系树推断；基于AUCell算法的转录因子模块评分；基于LIANA+的配体-受体互作分析；基于10x Xenium 5k的空间转录组分析；以及基于CRISPR-Cas9的基因编辑和四倍体胚胎互补技术构建基因修饰小鼠。

**肾元祖细胞的异质性** 研究人员聚焦肾脏发育中的肾元祖细胞，通过标志物Six2和Osr1的表达鉴定NPC群体。无监督聚类分析揭示六个NPC亚群（NPC1-NPC6）。RNA速度分析显示NPC1为E10-11特异性短暂群体，是所有其他亚群的来源，特征性表达Six1及干性维持相关基因。NPC3在E15.0左右比例达峰，表达Mki67和Cdca8等增殖相关基因。NPC6于E16.0后出现，富集Klf4、Maff、Cebpb等上皮分化基因以及Dusp10、Il33、Nfkbiz等免疫应答基因。基于10x Xenium 5k平台的空间转录组分析证实，E18.0的NPC微环境中Notch信号等上皮分化通路及Ccn1、Thbs1、Irf9等免疫相关基因表达上调，提示晚期妊娠肾脏免疫微环境发生改变。

**E14.5后上皮细胞加速分化** 研究人员系统追踪五种主要细胞谱系的亚型累积动态，发现神经、间充质和造血谱系在E11.0-14.0快速多样化，而上皮细胞呈现独特的晚期加速模式。E14.5-17.5新生成的上皮亚型数量（112个）远超E11.0-14.0（64个）。以肺上皮为例，E11.0-14.0主要为早期远/近端祖细胞，而E14.5-17.5则出现肺泡Ⅰ/Ⅱ型细胞、纤毛细胞、棒状细胞和杯状细胞等成熟类型。Palantir算法量化的分化潜能分析证实此时期上皮细胞命运确定性迅速增强。差异表达基因分析显示晚期上调基因主要富集于器官特异性功能通路。

**Tub调控垂体激素产生细胞分化** 研究人员发现垂体特异性转录因子Tub在晚期发育阶段上调。通过最优传输算法推断上皮细胞的祖先-后代关系，构建跨时间点的谱系轨迹树以可视化Tub表达动态。为验证Tub功能，研究人员利用Lhx3-iCre系统构建垂体特异性Tub条件敲除小鼠。E18.5分析显示Tub-cKO胚胎垂体前叶TUB表达缺失，前叶尺寸减小。单细胞测序揭示FSHβ阳性促性腺激素细胞比例显著降低。免疫荧光证实Tub-cKO小鼠E18.5前叶FSHβ细胞减少，该表型在P17更为显著。纵向体重监测显示Tub-cKO小鼠进行性增重，2月龄时出现肥胖。

**讨论** 研究人员指出，mdCLA的建立填补了现有小鼠胚胎单细胞图谱在时间连续性和转录深度方面的空白。该标准化数据集消除了跨实验室整合中的批次效应，在细胞亚型和标志物鉴定方面具有显著优势。研究揭示的NPC新亚群为理解肾元数量调控提供了分子线索。谱系分化分析发现上皮细胞在E14.5后的加速分化规律，这与中胚层来源的间充质等谱系形成鲜明对比。早期间充质细胞分化可能为后续上皮细胞多样化提供必要的微环境支持，但多细胞协同分化的机制仍有待探索。Tub作为晚期激活的基因，在垂体上皮成熟和终末细胞命运决定中发挥关键作用，其缺失导致FSH产生细胞减少和出生后肥胖，提示晚期妊娠激活的基因对器官成熟和出生后生理稳态建立至关重要。该数据集也存在一定局限：220万细胞总量相对于晚期胚胎总细胞数而言覆盖率不足，可能遗漏稀有细胞类型；液滴法对成熟神经元等大型细胞存在捕获偏倚；缺乏器官特异性采样限制了对某些细胞类型的精确定位和细胞互作分析。未来可通过整合器官特异性采样数据和浅测序高覆盖度数据来克服这些局限。研究团队已建立开放访问网站（http://mdcla.ccla.ac.cn/），以促进mdCLA的广泛应用。