《Nature Methods》：Neuropixels Opto: combining high-resolution electrophysiology and optogenetics
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高分辨率胞外电生理记录是分布式神经元群体峰电位（Spike）记录的金标准，与光遗传学（Optogenetics）结合可实现特定细胞类型的高时间分辨率操控时尤为强大。研究人员将这两种方法整合至Neuropixels Opto原型探针中，融合了电子与光子回路。该器
高分辨率胞外电生理记录是分布式神经元群体峰电位（Spike）记录的金标准，与光遗传学（Optogenetics）结合可实现特定细胞类型的高时间分辨率操控时尤为强大。研究人员将这两种方法整合至Neuropixels Opto原型探针中，融合了电子与光子回路。该器件在宽70 μm、长1 cm的探针柄（Shank）上集成了960个电信号记录位点和两组各14个光发射器，可实现蓝、红光的空间可寻址（Spatially Addressable）光遗传刺激。在小鼠皮层中，Neuropixels Opto探针在提供高质量记录的同时实现了空间可寻址光遗传学，可差异激活或抑制不同皮层深度的神经元。在小鼠纹状体及其他深部脑结构中，Neuropixels Opto探针实现了高效的光标记（Optotagging），有助于并行鉴定两种细胞类型。Neuropixels Opto探针是研究神经元群体记录、鉴定及操控前景广阔的工具。
《Nature Methods》刊载研究：Neuropixels Opto——集成高密度电生理记录与双色光遗传刺激的单探针平台解读
研究背景与立项依据
理解脑功能需同时实现大规模神经元记录、细胞类型鉴定及活动操控。传统高密度硅探针如Neuropixels可大规模记录胞外动作电位（Action Potential, AP）与局部场电位（Local Field Potential, LFP），而光遗传学（Optogenetics）可通过表达视蛋白（Opsin）的病毒或转基因动物实现对特定神经元群体的激活或抑制。将二者结合（即"光电极Optrode"）可因果性地测试特定神经环路功能并进行光标记（Optotagging，即通过光脉冲低延迟响应鉴定记录单元的细胞类型）。然而，现有光电极存在明显局限：结合光纤的光电极发光点少；集成微发光二极管（micro-LED, μLED）的光电极因μLED低效（1%–3%）产生局部脑组织升温（0.5–1.5 °C），限制光强与占空比；且既往器件记录位点少或光强弱，无法兼顾Neuropixels级别高密度记录与高强度空间分辨光刺激。为此，研究人员开发了原型Neuropixels Opto探针，将光生成置于脑外并通过单片集成氮化硅（Silicon Nitride, SiN）光子波导（Photonic Waveguide）将高强度光传导至探针柄上的发射器，规避了片上发热问题。
主要关键技术方法
研究采用单片集成130 nm绝缘体上硅（Silicon-On-Insulator, SOI）CMOS铝工艺（六层金属、氮化钛TiN记录位点）与150 nm厚SiN光子层的Neuropixels Opto探针（柄长10 mm、宽70 μm、厚33 μm；960个12×12 μm2 TiN记录位点，垂直间距20 μm，双列排布水平间距48 μm；可同时选通记录384个位点；两组各14个高阶切趾布拉格光栅耦合器作为发射器，沿柄轴间距100 μm，覆盖柄端1.5 mm范围，分别传输450 nm蓝光与638 nm红光）。外部450 nm与638 nm光纤耦合激光器通过光栅耦合器接入，经热光效应马赫-曾德尔干涉仪（Mach–Zehnder Interferometer, MIZ）构成的可编程二进制光子开关树独立寻址各发射器。为解决SiN引入的探针弯曲，沉积补偿与封盖SiN层将尖端偏转控制在<200 μm；为防止波导散射光干扰CMOS电路，增设TiN/Al遮光层。在体实验使用C57BL/6J野生型及多种Cre驱动系小鼠，经立体定位病毒注射（AAV携带CaMK2α-ChRmine-mScarlet、DLX2.0-ChrimsonR-tdTomato、Enhancer AAV-CoChR-EGFP等）表达红敏或蓝敏视蛋白，急性插入探针记录并用SpikeGLX或Open Ephys GUI控制数据采集与发射器选择，数据经Kilosort 2.5/4.0及SpikeInterface进行Spike Sorting与质量筛选。
研究结果
Probe design（探针设计）
探针将Neuropixels 1.0的CMOS读出电路与SiN光子波导单片集成。光子层含蓝光与红光波导及14×2个高阶切趾布拉格光栅耦合器作侧向发射器，光指向背离记录位点以减少光电商物伪迹（Photoelectric Artifact）。波导通过光纤—光栅耦合器接入，经四级二进制光子开关树路由至任意单个发射器（当前版允许每色同时开启一个发射器）。基端扩展PCB翅膀容纳光纤块与光子开关电路，整体连至PXI基站（含数据采集模块与双通道激光模块），软件兼容SpikeGLX与Open Ephys GUI。
Electrical and optical characterization（电学与光学表征）
尽管增敷光子层，平均电极阻抗138±27 kΩ，AP与LFP频段均方根噪声分别为5.45±0.02 μV与5.33±0.03 μV（n=20097位点，21根探针），优于Neuropixels 1.0与2.0。红光平均发射效率2.07%±0.02%，蓝光0.24%±0.01%（n=434发射器，31根探针）；总损耗红光约17 dB、蓝光约26.5 dB（蓝光波导传播损耗3.0 dB/cm，红光0.5 dB/cm）。输出100 μW需输入红光~5 mW、蓝光~40 mW，可由外部激光轻易提供。100 μW输出时光功率密度>10 mW/mm2体积超470000 μm3，延伸超100 μm，满足ChR2等视蛋白激活阈值（1–10 mW/mm2）。由于发射器指离记录位点，光刺激引入仅~30 μV微小电学伪迹（仅见于红光陡升沿），经标准预处理可去除，远小于直接照射记录位点的>1 mV伪迹。
Activating local neural populations（激活局部神经元群体）
在V1区CaMK2α-ChRmine-mScarlet表达小鼠中，随机激活单个发射器（638 nm，400 ms渐变方波）可引发紧邻发射器深度附近兴奋性神经元特异性发放增强，不同深度发射器可空间分辨激活不同亚群，激活范围半高全宽（FWHM）151±71 μm，与100 μm发射器间距匹配，证实皮层深度方向空间可寻址光遗传激活。无病毒对照组及非表达区（海马）无光诱发活动，排除热效应或视网膜激活假阳性。单位产出率0.23±0.09单位/位点，与同期IBL数据库Neuropixels 1.0在同等区域结果（0.22±0.10）相当。
Driving local circuits（驱动局部环路）
在DLX2.0-ChrimsonR-tdTomato（假定抑制性神经元表达）小鼠中，红光刺激激活窄峰宽快发放（Fast-Spiking, FS）抑制性中间神经元并使宽峰宽锥体样神经元发放抑制，跨相关（Cross-Correlogram, CCG）显示 putative单突触抑制连接，调制强度随光强递增，证实探针可诱导局部抑制性环路效应且具有空间局限性。
Optotagging nearby neurons（邻近神经元光标记）
在纹状体Adora2a-Cre小鼠中共表达D1 MSN特异性CoChR-EGFP（蓝敏）与D2 MSN特异性ChRmine-mScarlet（红敏），以20 Hz、10 ms、100 μW脉冲序列从各色发射器随机穿插刺激。光标记判定标准：≥4/5脉冲较基线升发放、驱动发射器≥30%试次引致≥1棘波、潜伏期<8 ms。结果成功并行标记两型MSN（25/39单元被标记），标记单元沿柄横向覆盖全70 μm宽度，纵向相对最近发射器分布与未标记单元无差异（P=0.58, KS检验），说明100 μm发射器间距无光标记盲区。全实验累计40场次26只小鼠标记261个单元，涵盖多种Cre系与视蛋白组合（CoChR、ChRmine、ChrimsonR、rsChRmine、somBiPOLES）。
讨论与结论翻译
得益于集成CMOS与光子学，Neuropixels Opto探针为单一器件实现大规模神经元记录与空间可寻址光遗传学提供解决方案。研究表明该探针可在脑结构纵深提供精细空间可寻址光遗传激活/抑制并保持高分辨率记录，适用于新皮层及其他区域环路解析，亦非常适于光标记以鉴定纹状体等区域多数记录单元的细胞类型。皮层实验中观察到高度局限的光遗传激活，可能与较低光强及探针发射器聚焦照明范围有关；但一光子在散射介质中的空间分辨仍受组织散射、神经元形态及视蛋白分布限制。原型探针制造步骤约740步（Neuropixels 1.0/2.0约400步），未来改进方向含：蓝光开关与波导分层独立、集成光电探测器监测各发射器功率实现反馈重校准、借鉴Neuropixels 2.0后端缩小基座尺寸简化激光—探针耦合、增加红蓝光发射器数目。研究人员预期Neuropixels Opto将成为全脑范围结合高密度胞外电生理记录与局部光遗传操控及细胞类型特异性电生理鉴定的重要工具。
