RAS(ON)抑制剂双靶点联合阻断致癌RAS信号通路为免疫治疗耐药的KRASG12C突变NSCLC增敏免疫检查点阻断

《Cancer Discovery》：Abrogation of Oncogenic RAS Signaling by a RAS(ON) Inhibitor Doublet Primes Immune-Refractory KRASG12C-Mutant NSCLC for Immune Checkpoint Blockade Open Access

为应对KRAS^G12C突变非小细胞肺癌（NSCLC）中RAS通路过度活化及靶向治疗耐药问题，研究人员评估了RAS(ON) G12C选择性共价抑制剂elironrasib与RAS(ON)多选择性抑制剂daraxonrasib联合应用以最大化RAS通路抑制并延缓通路再激活的潜力。研究人员在一系列临床前模型中证实，该RAS(ON)抑制剂双靶点方案可诱导深度且持久的肿瘤消退，并克服导致NSCLC对KRAS^G12C失活态选择性抑制剂产生耐药的RAS通路致癌性flux升高。此外，在免疫健全的临床前模型中，RAS(ON)抑制剂双靶点方案通过增强抗原呈递和重塑抑制性肿瘤微环境（TME）来促进肿瘤免疫识别，从而驱动免疫依赖性的完全消退，并使免疫治疗耐药模型对检查点阻断增敏。这些发现共同为RAS(ON)抑制剂双靶点治疗方案联合免疫检查点阻断（ICB）用于KRAS^G12C突变NSCLC患者的临床评估提供了临床前依据。意义：RAS(ON) G12C选择性与RAS(ON)多选择性抑制剂的联合可缓解KRAS^G12C(OFF)抑制剂的临床耐药机制并增强肿瘤免疫识别，克服ICB耐药。这些临床前发现凸显了RAS(ON)靶向治疗方案联合抗PD-(L)1用于KRAS^G12C突变NSCLC患者的潜力。

RAS基因家族（KRAS、NRAS和HRAS）的致癌性突变驱动多种人类恶性肿瘤的生长，在胰腺导管腺癌（PDAC, >90%)、结直肠癌（约50%）和非小细胞肺癌（NSCLC, 约30%）中发生率最高，每年在美国约占20万例新诊断癌症。作为KRAS中常见的热点突变，12位甘氨酸至半胱氨酸的氨基酸替换（G12C）在携带KRAS突变的NSCLC患者中占主导地位，约占此类病例的40%。

KRAS^G12C突变选择性抑制剂索托拉西布（sotorasib, Lumakras）和阿达格拉西布（adagrasib, Krazati）的发现及美国食品药品监督管理局（FDA）批准已重塑了KRAS^G12C突变晚期NSCLC的治疗格局。这些抑制剂通过共价修饰突变半胱氨酸残基，选择性靶向GDP结合失活态的KRAS^G12C蛋白[KRAS^G12C(OFF)]。然而，KRAS^G12C(OFF)抑制剂治疗的临床疗效受到原发性和获得性耐药机制的限制，提示需要更优的治疗药物和有效的联合方案。为应对RAS成瘾性癌症中高度未满足的医疗需求，研究人员开发了一系列选择性靶向GTP结合活化态RAS [RAS(ON)]的三复合物抑制剂，包括研究药物elironrasib（RAS(ON) G12C选择性共价抑制剂）和daraxonrasib（RAS(ON)多选择性抑制剂）。elironrasib和daraxonrasib单药治疗在临床前模型中均已显示出显著的抗肿瘤活性，且近期在晚期RAS突变实体瘤患者中于耐受剂量水平展现出初步临床活性证据。

通过直接靶向RAS^G12C(ON)，elironrasib有望缓解KRAS^G12C(OFF)抑制剂观察到的部分临床耐药机制。在临床前模型中，RAS(ON) G12C选择性抑制剂对RAS通路过度活化的敏感性较低，而后者源于KRAS^G12C(ON)蛋白水平升高、上游受体酪氨酸激酶（RTK）激活和/或KRAS^G12C的开关II结合口袋突变，这些因素均可导致KRAS^G12C(OFF)抑制剂耐药。与此观察一致，elironrasib在KRAS^G12C(OFF)抑制剂进展后患者中的初步临床活性已有报道。然而，作为RAS(ON) G12C选择性抑制剂，elironrasib无法解决其他潜在逃逸机制，如通过H/N或KRAS介导的野生型（WT）RAS通路再激活、RTK改变或新发继发性RAS突变。而daraxonrasib可对突变型和野生型K、N、HRAS变体实现广谱抑制，因此应能应对上述机制。由此，elironrasib联合daraxonrasib的RAS(ON)抑制剂双靶点方案相较于KRAS^G12C选择性抑制剂单药治疗，可能为KRAS^G12C突变NSCLC患者带来更优的治疗结局。该联合方案应能最大化肿瘤内源性RAS通路抑制，并对KRAS^G12C(OFF)抑制剂治疗后进展患者观察到的多种获得性临床耐药机制具有更强的抵御能力。

晚期NSCLC（包括携带KRAS突变的患者）的一线治疗包括免疫检查点阻断（ICB）联合抗PD-1/抗PD-L1免疫治疗，常联合化疗，有时联合抗CTLA-4药物。KRAS^G12C突变NSCLC患者（通常与吸烟相关）相较于非G12C KRAS突变患者，往往表现出更高的肿瘤突变负荷（TMB）和升高的PD-L1表达，可能由此增加对免疫治疗的敏感性。然而，该患者群体中相当部分无法从ICB中获益，其中MHC I类分子下调是NSCLC中常见的免疫逃逸机制。此外，突变型KRAS已被证实可维持免疫抑制性肿瘤微环境（TME），并通过多种机制促进癌细胞免疫逃逸，包括分泌抗炎性趋化因子和细胞因子、促进免疫抑制性调节细胞的分化和浸润、抑制T细胞活化，以及通过MHC I类下调和肿瘤细胞膜PD-L1上调来抑制细胞毒性CD8⁺ T细胞介导的肿瘤杀伤。临床前研究表明，KRAS靶向治疗可通过增强适应性免疫应答部分逆转这种免疫抑制性TME，促使多项临床试验评估KRAS^G12C(OFF)突变选择性抑制剂与ICB在KRAS^G12C突变NSCLC中的联合应用。部分联合方案的早期临床获益迹象已有报道，尽管确定可耐受联合方案 apparently 面临挑战。临床前研究提示，ICB联合突变选择性RAS抑制剂的潜在获益可能仅限于高淋巴细胞浸润的免疫原性NSCLC肿瘤，而不延伸至免疫排斥型肺癌。因此，需要更有效的联合治疗方案以增加T细胞浸润和增强肿瘤识别，从而拓展ICB在NSCLC中的活性范围。

本研究中，研究人员在KRAS^G12C抑制剂单药治疗耐药的KRAS^G12C突变NSCLC临床前模型中，评估了elironrasib联合daraxonrasib的RAS(ON)抑制剂双靶点方案的治疗潜力，包括携带已知导致KRAS^G12C(OFF)抑制剂临床耐药的基因组改变者。研究人员证明该RAS(ON)抑制剂双靶点方案能够克服这些障碍，驱动持续的RAS通路抑制以及比任一单药更深度、更持久的应答。这些效应通过致癌性KRAS^G12C抑制的药代动力学（PK）/靶点结合（TE）/药效学（PD）建模得到进一步支持。此外，研究人员表明，通过RAS(ON)抑制剂双靶点方案最大化RAS通路抑制可促进肿瘤免疫识别并激活适应性免疫，驱动免疫依赖性的长期完全肿瘤应答，从而使ICB难治性NSCLC肿瘤对anti-PD-1增敏。这些临床前数据共同支持将elironrasib、daraxonrasib和ICB三联组合策略作为KRAS^G12C突变NSCLC患者靶向治疗方案进行临床评估。

本研究发表于《Cancer Discovery》，主要运用了以下关键技术方法：多种临床前肿瘤模型体系，包括细胞系来源异种移植（CDX）模型、患者来源异种移植（PDX）模型（含来自单一机构的新型PDX队列）、遗传工程小鼠模型（GEMM）来源的同种移植模型以及免疫健全的同种移植模型；药代动力学/靶点结合/药效学（PK/TE/PD）数学建模；免疫组化（IHC）、免疫荧光原位杂交（DNA FISH）、RNA原位杂交（RNA ISH）及多参数光谱流式细胞术；转录组学分析（批量RNA测序及PROGENy通路分析）；T细胞受体（TCR）测序及免疫组库分析；以及肿瘤微环境免疫细胞组成与功能分析等。

研究成果部分，"RAS(ON)抑制剂双靶点方案在难治性KRAS^G12C突变NSCLC模型中诱导深度且持久的应答"：研究人员既往报道elironrasib单药在广泛的KRAS^G12C突变NSCLC CDX和PDX模型面板中显示出显著抗肿瘤活性，总缓解率（ORR）为72%（18/25）。在长期治疗实验（长达90天）中，这些应答相对持久。本研究聚焦于该面板中对elironrasib单药应答欠佳的模型队列（n=8），这些模型携带TP53、STK11、KEAP1、SMARCA4和CDKN2A缺失等共突变，不仅常见于KRAS^G12C突变NSCLC，且部分与KRAS^G12C(OFF)抑制应答降低或耐药相关。其中LUN055模型还表现出基线KRAS^G12C拷贝数增加，而突变KRAS^G12C扩增已被报道为失活态抑制剂获得性耐药的驱动因素。daraxonrasib单药治疗在此队列中ORR为38%（3/8），与elironrasib相似，但显示出显著改善的中位无进展生存期（mPFS=86天）。RAS(ON)抑制剂双靶点方案较任一单药显著改善抗肿瘤活性，ORR达75%（6/8），且在长达90天的治疗期间mPFS未达到。

"RAS(ON)抑制剂双靶点方案延缓RAS通路flux升高驱动的耐药"：研究人员假设双靶点方案的联合效应在难治性疾病背景下源于对突变型和/或野生型RAS驱动的致癌性RAS信号更深度的抑制。在NCI-H2122和NCI-H2030（均代表KEAP1和STK11缺陷型NSCLC）CDX模型及CTG-2536和LUN055 PDX模型中，研究人员首先确立了RAS信号升高在耐药中的作用。在CDX模型中，elironrasib或daraxonrasib单药治疗诱导初始肿瘤消退后继以治疗中再生长，而双靶点方案驱动持久的完全肿瘤消退。体外研究证实，双靶点较单药在48小时后产生更持续的RAS通路抑制，表现为下游关键信号组分ERK（pERK; Thr202/Tyr204）和P90RSK（pP90RSK; Thr359）磷酸化水平。在NCI-H2030细胞中，CRISPR介导的HRAS和NRAS敲除（KO）后，elironrasib显示出比亲代细胞更强和更持久的RAS通路抑制，而daraxonrasib在KO和亲代细胞间活性差异极小，证实野生型RAS蛋白在突变选择性RAS(ON)抑制剂治疗后维持通路flux中的关键作用。

RTK激活可促进KRAS^G12C和野生型RAS的GTP加载，增加RAS通路flux，从而预测增强对RAS(ON)抑制剂双靶点的敏感性。CTG-2536 PDX模型显示出高基线HER2 mRNA和蛋白水平，该模型中双靶点方案驱动长达90天的持久肿瘤消退，而单药仅显示肿瘤生长抑制。体外研究确认HER2或过癌基因RET^M918T过表达降低elironrasib抗增殖效力，但不影响双靶点方案活性。

LUN055 NSCLC PDX模型（KRAS^G12C基因拷贝数=25）中，elironrasib和daraxonrasib单药驱动初始肿瘤消退但出现治疗中复发。长期单药治疗后观察到KRAS^G12C基因拷贝数进一步增加，荧光原位杂交（FISH）验证基线及治疗诱导的KRAS扩增，长期使用elironrasib后KRAS mRNA和RAS蛋白水平升高。双靶点方案在LUN055 PDX模型中诱导长达90天的深度持久肿瘤消退，显示其延缓突变KRAS扩增/过表达所致治疗耐药的潜力。

"RAS(ON)抑制剂双靶点方案驱动持续的RAS通路抑制、抑制细胞增殖并诱导体内凋亡"：研究人员通过PK/TE/PD分析探索双靶点方案的联合获益机制。elironrasib系统暴露量在单药或重复给药后一致，与daraxonrasib联用时未改变。elironrasib的KRAS^G12C TE在NCI-H2122异种移植肿瘤中8小时后达近完全（>99%）交联，24和48小时后分别降至81%和52%。联用daraxonrasib不影响elironrasib的KRAS^G12C TE。elironrasib诱导>95%的RAS通路信号抑制（通过人DUSP6 mRNA表达下调评估），持续至给药后8小时；daraxonrasib单药诱导略深且更持久的RAS通路抑制，而双靶点方案表现出类似深度但更持久的抑制，维持>99% DUSP6抑制及持续的pERK和pS6蛋白水平抑制至治疗后48小时。7天联合给药后所有检测时间点肿瘤细胞增殖（Ki67阳性）均显著受抑。单药和联合治疗均在给药后8或24小时显著增加凋亡（较对照增加2-4倍），通过肿瘤中切割型caspase 3（CC3）水平评估。NCI-H2030和CTG-2536异种移植肿瘤中观察到类似的持续RAS通路抑制和凋亡诱导增强。

"互补机制的PK/TE/PD模型预测在KRAS^G12C过表达背景下RAS(ON)抑制剂双靶点优于单药"：研究人员开发了数学PK/TE/PD模型，关联daraxonrasib的循环血药浓度和elironrasib的血浆浓度与各自的肿瘤浓度、KRAS^G12C TE及DUSP6 mRNA表达。模型纳入elironrasib对KRAS^G12C的快速共价交联机制，而daraxonrasib通过非共价结合游离KRAS^G12C发挥抑制作用。模拟联合给药在整个给药期间较任一单药产生更深的DUSP6 mRNA抑制。针对KRAS^G12C扩增（模拟高达八倍的KRAS^G12C蛋白过表达），elironrasib单药显示游离KRAS^G12C和DUSP6 mRNA表达的加速反弹；daraxonrasib单药因较长肿瘤滞留时间维持持久抑制，但深度降低。八倍KRAS^G12C蛋白稳态水平增加时，无一单药能维持>90%的DUSP6 mRNA降低，而双靶点方案预测在整个给药期间维持≥98%的DUSP6抑制。

"daraxonrasib、elironrasib及RAS(ON)抑制剂双靶点在免疫健全小鼠中驱动免疫依赖性肿瘤清除并与anti-PD-1在免疫原性NSCLC模型中协同"：研究人员首先评估了daraxonrasib单药及联合anti-PD-1相较于elironrasib在免疫原性KPAR1.3 GEMM来源同系NSCLC模型中的活性。anti-PD-1单药延迟肿瘤生长；daraxonrasib单药实现10%（1/10）持久完全缓解（CR），联合anti-PD-1达60%（6/10）持久CR；elironrasib单药10%（1/10）CR，联合anti-PD-1达90%（9/10）CR。RAS(ON)抑制剂双靶点较单药产生更深更持久的应答，80%（8/10）CR；三联方案（daraxonrasib+elironrasib+anti-PD-1）使所有小鼠（10/10）在治疗撤除后防止肿瘤复发。CD4⁺ T、CD8⁺ T和NK细胞联合耗竭实验显示，适应性免疫系统对该模型中RAS(ON)抑制持久应答不可或缺。

"RAS(ON)抑制剂双靶点最大化通路抑制并有利调节ICB难治性NSCLC模型的TME"：研究人员利用Kras^G12C依赖性3LL-ΔNRAS小鼠模型模拟ICB难治性NSCLC人群，该模型携带Cdkn2a/b缺失、T细胞排斥型TME、免疫抑制细胞主导，且尽管高TMB但对药理学干预普遍耐药，MHC I类（H2-K^b）表达受抑。双靶点方案在此模型中实现与异种移植模型相当的通路最大化抑制，组化显示pERK表达降低，转录组分析证实。DNA复制（G2M PROGENy评分）和增殖（Ki67 IHC）的减少确认双靶点应答深度增加。该PD调节伴随TME的显著有利调节：急性应答期，M2巨噬细胞和粒细胞样髓源抑制细胞（gMDSC）浸润减少，CD4⁺和CD8⁺ T细胞及NK细胞比例增加；免疫排斥型肿瘤变为T细胞浸润；仅双靶点方案诱导肿瘤细胞的MHC I类（H2-K^b）显著表达和颗粒酶B（GzmB）IHC染色增加。

"RAS(ON)抑制剂双靶点最大化抗原呈递并使ICB难治性NSCLC肿瘤模型对anti-PD-1增敏"：批量RNA-seq显示elironrasib或daraxonrasib单药均增加抗原加工和呈递机制基因表达，双靶点方案上调最强。TCR测序显示所有治疗均增加T细胞丰度，双靶点方案最显著。T细胞浸润增加与终点肿瘤体积减少相关。所有治疗显著增加肿瘤内汇聚克隆（共享抗原特异性的TCR）的总频率，双靶点方案组共享TCR克隆数（按氨基酸和V基因计）显著高于单药，提示更广泛、更聚焦的共享肿瘤抗原T细胞应答。elironrasib和daraxonrasib单药分别驱动10%（1/10）和30%（3/10）CR，但大多数肿瘤治疗中复发；双靶点方案初始更深消退，但大多数仍复发（90%）。elironrasib和daraxonrasib虽深刻重塑TME，但未增加MHC I类者未能使肿瘤对anti-PD-1敏感。双靶点方案通过增强肿瘤识别使该ICB难治性模型对anti-PD-1敏感，驱动100%（10/10）持久CR（154天）。肿瘤清除小鼠约2个月后对侧 flank 再挑战实验显示，先前经RAS(ON)单药或双靶点治疗的小鼠均未见肿瘤生长，表明RAS(ON)抑制促进系统性抗肿瘤免疫和免疫记忆。

讨论部分，FDA批准sotorasib和adagrasib标志着KRAS^G12C突变癌症靶向治疗的重要进展，但一代KRAS^G12C(OFF)抑制剂单药因原发性和获得性耐药机制（多数涉及肿瘤中RAS通路再激活）而临床疗效有限。本研究利用全面的KRAS^G12C突变NSCLC临床前模型（包括来自单一机构的新组装患者来源系列），证明"加倍"抑制致癌性和野生型RAS(ON)的elironrasib和daraxonrasib新型RAS(ON)抑制剂双靶点方案的获益。研究人员既往报道elironrasib和daraxonrasib单药可克服KRAS^G12C(OFF)抑制剂的部分局限，本研究进一步显示联合治疗带来持续的RAS通路抑制和较任一单药改善的抗肿瘤活性，更有潜力规避RAS通路flux升高（如RTK激活或KRAS^G12C扩增）驱动的耐药。

PK/TE/PD数学模型阐明了elironrasib的共价和daraxonrasib的非共价KRAS^G12C抑制之间的关系。elironrasib高效共价KRAS^G12C抑制剂的持久性主要取决于肿瘤细胞中新KRAS^G12C蛋白合成所需时间。daraxonrasib通过可逆性靶向KRAS^G12C(ON)蛋白并空间位阻破坏下游效应子结合来抑制RAS通路信号，其相对较长的肿瘤滞留时间驱动持久通路抑制。两种RAS(ON)抑制剂机制互补，联合时elironrasib快速且不可逆地交联KRAS^G12C蛋白，减少daraxonrasib需结合的蛋白池，预测在包括亚优剂量水平和KRAS^G12C扩增设定下，实现比单药更深更持久的RAS通路抑制。模型预测双靶点优势随KRAS^G12C水平增加而日益显著。

大量证据支持致癌性RAS（及其他致癌基因）在癌症免疫抑制中的关键作用。本研究中，eliron rasib在免疫原性同系Kras^G12C突变NSCLC模型中与ICB协同，与既往报道一致。daraxonrasib诱导的抗肿瘤免疫应答（包括T细胞浸润、免疫记忆诱导及与anti-PD-1的联合获益）与RAS(ON) G12C选择性抑制剂相当，这一发现具有重要意义：尽管RAS(ON)多选择性抑制剂如daraxonrasib可靶向免疫细胞中RAS^WT并在体外抑制初始T细胞增殖，但既往显示不影响预激活T细胞体外增殖或体内T细胞启动。研究人员进一步强调了适应性免疫在T细胞浸润肿瘤中实现持久CR中的关键作用。

在T细胞排斥型、MHC I类受抑的NSCLC肿瘤中，daraxonrasib联合elironrasib最大化RAS通路抑制，驱动抗原呈递和T细胞浸润的显著增加。相应TCR组库分析揭示汇聚性增加和更高数量的跨肿瘤共享TCR克隆，提示肿瘤驻留T细胞对肿瘤抗原的识别增强。这些发现支持RAS(ON)抑制剂双靶点方案重编程TME并使ICB难治性肿瘤对anti-PD-1治疗敏感的能力。最大化RAS通路抑制可能恢复NSCLC的免疫原性并将免疫治疗的临床获益扩展至当前无应答的患者。类似策略如BRAF和MEK抑制剂联合anti-PD-1在ICB难治性BRAF^V600E突变微卫星稳定型结直肠癌中已显示令人鼓舞的活性。观察到的抗原呈递增加和TCR识别扩展也为RAS(ON)抑制联合疫苗基础免疫治疗的评估提供了依据。最后，联合免疫治疗可能有助于清除RAS抑制后出现的新生耐药克隆。

本研究凸显了elironrasib联合daraxonrasib的RAS(ON)抑制剂双靶点方案在KRAS^G12C突变NSCLC单药治疗难治模型中加深和延长抗肿瘤活性的潜力。尽管本研究聚焦于KRAS^G12C突变NSCLC肿瘤，实验证据和潜在机制提示该策略可能推广至其他突变选择性抑制剂和/或肿瘤类型。同样，RAS(ON)抑制剂双靶点方案消除TME中关键免疫逃逸机制并产生免疫治疗脆弱性的潜力可能适用于其他免疫难治性肿瘤。总之，这些令人鼓舞的临床前结果为elironrasib和daraxonrasib的RAS(ON)抑制剂双靶点方案联合帕博利珠单抗用于KRAS^G12C突变NSCLC患者的评估提供了强有力的科学依据（NCT06162221）。

研究结论：RAS(ON) G12C选择性和RAS(ON)多选择性抑制剂的联合缓解了KRAS^G12C(OFF)抑制剂的临床耐药机制并增强肿瘤免疫识别，克服ICB耐药。这些临床前发现凸显了RAS(ON)靶向治疗方案联合抗PD-(L)1用于KRAS^G12C突变NSCLC患者的潜力。