《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Necroptosis triggers inflammatory interferon signatures in patient-derived metastatic breast cancer organoids
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乳腺癌（BC）是全球女性最常见的癌症类型，是复发、疾病进展和转移的基础。对化疗和程序性细胞死亡（PCD）（包括凋亡）的耐药性严重影响BC治疗的成功率，并仍是一个主要挑战。尽管坏死性凋亡（necroptosis）是一种裂解性的、并通过损伤相关分子模式（DAMP）
乳腺癌（BC）是全球女性最常见的癌症类型，是复发、疾病进展和转移的基础。对化疗和程序性细胞死亡（PCD）（包括凋亡）的耐药性严重影响BC治疗的成功率，并仍是一个主要挑战。尽管坏死性凋亡（necroptosis）是一种裂解性的、并通过损伤相关分子模式（DAMP）释放而具有高度免疫原性的PCD形式，可能克服凋亡抵抗，但迫切需要生理性和转化性人类模型来模拟BC中的坏死性凋亡和PCD耐药性。在此，研究人员应用三维患者来源的转移性人乳腺类器官（hMOs），通过单细胞CITE测序（scCITEseq）、时间延迟活细胞明场和免疫荧光共聚焦显微镜以及生化方法，对凋亡抵抗、坏死性凋亡和炎症信号进行建模。Smac模拟物触发的凋亡可在BC hMO组中得到确认。在通过半胱天冬酶（caspase）抑制诱导凋亡抵抗后，BC hMO迅速发生坏死性凋亡，伴有显著的MLKL（混合谱系激酶结构域样假激酶）磷酸化。坏死性凋亡细胞死亡之前，炎症性细胞因子和趋化因子（包括干扰素）的转录显著上调，这些因子可激活自然杀伤（NK）细胞。最后，在转移性BC hMO中，坏死性凋亡以及炎症信使的表达和释放可通过抑制线性泛素化而减弱。研究人员描述了一种新型实验平台，用于模拟PCD、炎症和坏死性凋亡，该平台允许在患者来源的转移性BC hMO中进行治疗筛选以克服化疗耐药性。利用该平台，研究人员鉴定了坏死性凋亡诱导的干扰素信号，提示Smac模拟物和坏死性凋亡是一种针对转移性BC的潜在免疫治疗策略。
**坏死性凋亡触发患者来源的转移性乳腺癌类器官中的炎症性干扰素特征——论文解读**
**研究背景**
乳腺癌（breast cancer, BC）是全球女性最常见的恶性肿瘤，其高发病率与复发、转移及化疗耐药密切相关。肿瘤细胞对程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD），尤其是凋亡（apoptosis）的抵抗，是导致治疗失败的关键障碍。坏死性凋亡（necroptosis）是一种裂解性、可通过释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）诱发强烈免疫反应的PCD形式，有望克服凋亡抵抗。然而，目前缺乏能够模拟人类乳腺癌中坏死性凋亡与PCD耐药的生理相关性模型。患者来源的类器官（organoids）因其保留原肿瘤特征、维持三维（3D）细胞间相互作用而成为理想的临床前模型。本研究旨在利用转移性乳腺癌患者来源的人乳腺类器官（human mammary organoids, hMOs）建立一套转化性实验平台，系统研究PCD敏感性、坏死性凋亡及其伴随的炎症信号，并评估线性泛素化（linear ubiquitination）在其中的调控作用。该研究发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
**主要技术方法**
研究人员从三个转移性乳腺癌患者（luminal A及B亚型）的活检组织中建立并稳定培养了hMO系（来自HUB Organoid Technology）。关键技术包括：单细胞CITE-seq（scCITEseq）进行转录组与表位联合分析；时间延迟活细胞明场显微镜及免疫荧光共聚焦显微镜实时监测细胞形态与死亡；免疫印迹（Western blot）、实时定量PCR（RT-qPCR）及流式细胞术的细胞微球阵列（CBA）检测蛋白磷酸化、基因表达及分泌因子；药理学干预使用Smac模拟物（BV6、Birinapant等）、泛半胱天冬酶抑制剂Emricasan、RIPK1抑制剂Nec-1s、MLKL抑制剂坏死磺酰胺（NSA）及线性泛素化链组装复合物（LUBAC）抑制剂HOIPIN-8。
**研究结果**
**1. 建立表征转移性BC hMO中PCD与炎症的转化平台**
三个供体来源的hMO在形态上存在差异：供体#1和#3呈紧凑圆形，供体#2呈“葡萄串”状。均表达luminal标志物细胞角蛋白8（cytokeratin-8），不表达basal标志物细胞角蛋白14。Ki67阳性细胞比例与增殖速率一致，且E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达缺失的供体#2增殖更快。scCITEseq分析将细胞分为22个簇，验证了基因表达模式。
**2. 转移性hMO表现为luminal样BC亚型并具有供体特异性表达特征**
免疫荧光显示供体#2高表达GATA-3（核定位），供体#1中度表达，供体#3几乎缺失；CD49f在三个供体中均有表达。基因集富集分析（GSEA）显示合并数据中缺氧信号及p53通路显著上调；供体特异性分析显示供体#1富集MYC信号，供体#2富集缺氧、糖酵解及TNF-α/NF-κB信号，供体#3富集雌激素应答。
**3. Smac模拟物诱导cIAP1/2降解及供体特异性细胞活力下降**
Western blot证实Smac模拟物（BV6、Birinapant、ASTX-660、LCL-161）均诱导cIAP1降解，并促进caspase-3裂解。BV6在三个供体中均显著降低细胞活力（35%–50%），而其他Smac模拟物呈供体特异性效应。活/死细胞定量显示BV6使死亡细胞增加4–24倍，其余药物效果较弱。
**4. Smac模拟物在患者来源BC hMO中诱导PCD**
Birinapant处理12小时后hMO出现形态改变（细胞从类器官中突出），18小时后形成类似凋亡小体的囊泡。加入Emricasan（BiE）后类器官更紧凑，细胞肿胀，死亡细胞数增加。免疫荧光显示仅Birinapant处理导致裂解caspase-3阳性，而BiE处理导致RIPK1 Ser166磷酸化，提示坏死性凋亡。BV6作用相似但更强。
**5. 药理学调节LUBAC及坏死性凋亡效应物可挽救BirinaPant-Emricasan诱导的PCD**
RIPK1抑制剂Nec-1s、MLKL抑制剂NSA及LUBAC抑制剂HOIPIN-8均可减少BiE诱导的细胞死亡，并恢复细胞活力（供体#3除外，其MLKL蛋白水平极低）。Western blot证实BiE处理诱导RIPK1、RIPK3及MLKL磷酸化，Nec-1s阻断此磷酸化，NSA不阻断（因作用于MLKL下游），HOIPIN-8不改变磷酸化但延迟坏死性凋亡。HOIPIN-8预处理的类器官富集活性氧（ROS）通路（GCLM、GCLC、LUCAT1上调）及脂肪酸代谢。
**6. 坏死性凋亡诱导转移性hMO分泌炎症介质**
BiE处理的hMO中TNF及CXCL10 mRNA表达显著升高，HOIPIN-8预处理降低其表达。CBA检测显示上清中TNF-α及IP-10（CXCL10编码）蛋白分泌增加，HOIPIN-8逆转此效应。scCITEseq分析鉴定出供体非依赖性的干扰素刺激基因（ISGs）如MX1、IFIT1、OAS3、STAT1、ISG15高表达。伪批量GSEA证实干扰素γ（IFN-γ）及α（IFN-α）应答及TNF-α/NF-κB信号通路强烈激活。
**7. 坏死性凋亡hMO诱导NK细胞应答**
将NK-92 MI细胞与坏死性凋亡hMO的条件培养基共培养4小时后，NK细胞中IRF9、IFIT1及IFNG mRNA表达上调，而细胞毒性标志物NCR1、PRF1、GZMB无显著变化，提示NK细胞被激活但未达到功能性细胞毒性阶段。
**讨论与结论**
本研究表明，患者来源的转移性BC hMO是研究PCD敏感性及炎症信号的适宜模型，并提供了一个可用于个性化精准医学、免疫治疗及药物筛选的吸引人的实验平台。通过诱导坏死性凋亡，研究人员发现干扰素刺激基因（ISGs）及干扰素信号是炎症反应的关键驱动因素。线性泛素化（由LUBAC介导）在坏死性凋亡中起调控作用，抑制LUBAC可减轻炎症介质的释放。此外，坏死性凋亡可通过激活NK细胞增强抗肿瘤免疫。研究结论：原发性患者来源的BC hMO可作为研究PCD敏感性和炎症信号的合适模型，并为个性化精准转化方法、免疫治疗和药物筛选提供有吸引力的实验平台。通过诱导坏死性凋亡，研究人员鉴定出ISGs和干扰素信号是炎症反应的驱动因素之一。在先进的类器官-免疫细胞共培养系统中研究抗肿瘤免疫的增强，可能改善患者治疗，尤其是对凋亡抵抗型BC。
