《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Dual epitope anti-LILRB4 synthetic T-cell receptor and antigen receptor (STAR)-T-cell therapy for relapsed/refractory acute myeloid leukemia
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摘要：急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种进展迅速的恶性肿瘤，预后较差。迄今为止，AML中嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法的应用受限于缺乏AML细胞高特异性的抗原。
摘要：急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种进展迅速的恶性肿瘤，预后较差。迄今为止，AML中嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法的应用受限于缺乏AML细胞高特异性的抗原。本研究开发了一种合成T细胞受体与抗原受体-T（Synthetic T-cell Receptor and Antigen Receptor-T, STAR-T）细胞疗法，靶向LILRB4——一种在单核细胞性AML原始细胞中高表达、但在造血干细胞中不表达的免疫抑制性受体。研究人员通过噬菌体展示文库筛选获得两个对LILRB4亲和力最高的纳米抗体（nanobody/VHH），并用于构建基于纳米抗体的双表位抗-LILRB4 STAR-T细胞，其在体外和体内显示出比单表位抗-LILRB4 STAR-T细胞或双表位抗-LILRB4 CAR-T细胞更强的肿瘤抑制能力。研究人员随后开展了首项人体临床试验（NCT05548088），纳入9例LILRB4阳性复发/难治性（Relapsed/Refractory, R/R）AML患者，其中6例完成安全性和有效性评估（中位随访10.7个月）。未观察到免疫效应细胞相关神经毒性（Immune Effector Cell-Associated Neurotoxicity Syndrome, ICANS）或≥3级细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome, CRS）。3例患者死于实验室确诊的感染。疗效可评估集中最佳总体缓解率（Overall Response Rate, ORR）为50.0%（3/6），全分析集ORR为33.3%。LILRB4阳性STAR-T细胞数量显著增加，LILRB4阳性靶细胞数量下降。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）揭示单核细胞介导的自体T细胞功能抑制可能是无应答者STAR-T治疗失败的主要机制。总之，这项首个人体试验证明了靶向LILRB4的STAR-T细胞疗法在AML中的治疗潜力，值得进一步研究。
靶向LILRB4双表位STAR-T细胞治疗复发/难治性急性髓系白血病的首个人体试验研究解读
本研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。急性髓系白血病（AML）尤其是伴单核细胞分化（FAB M4/M5亚型）的复发/难治性（R/R）AML预后极差，现有治疗手段有限。传统嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在AML中难以推广，主要因缺乏肿瘤特异性抗原——常用靶点如CD33、CD123亦表达于正常造血干/祖细胞，可导致严重的靶向外脱瘤毒性（on-target off-tumor toxicity）及持续骨髓抑制。白细胞免疫球蛋白样受体B4（Leukocyte Immunoglobulin-Like Receptor B4, LILRB4，亦称ILT3）在单核细胞性AML原始细胞及白血病干细胞（LSC）上高表达，而在正常造血干细胞（HSC）上基本不表达，且参与介导T细胞抑制和肿瘤浸润，是具潜力的选择性治疗靶点。合成T细胞受体与抗原受体（Synthetic T-cell Receptor and Antigen Receptor, STAR）融合了天然T细胞受体（TCR）与常规CAR的结构特点，利用TCR信号转导通路，具有更低的基础性（tonic）信号、更高抗原敏感性和更好信号保真度。本研究旨在开发靶向LILRB4的双表位纳米抗体STAR-T细胞，通过临床前验证后开展首个人体I期临床试验评估其安全性与初步疗效，并探究治疗应答与耐药机制。
主要关键技术方法：研究人员用重组LILRB4胞外区免疫羊驼构建噬菌体展示VHH（纳米抗体）文库，筛选获得两株结合不同表位的高亲和力抗-LILRB4纳米抗体（NLB4、NLB14），分别构建单表位及双表位（DE）抗-LILRB4 STAR及双表位CAR（DE-CAR）慢病毒载体并制备修饰T细胞；体外以LILRB4高/低表达AML细胞系（MV4-11、KASUMI-1）及原代CD34+HSC、诱导的髓源性抑制细胞（MDSC）评估细胞毒、细胞因子分泌及HSC安全性；建立MV4-11-luc及OCL-AML3-luc NCG小鼠异种移植瘤模型评估体内抗肿瘤效力及STAR-T/CAR-T细胞扩增持久性；开展开放标签、单臂I期临床试验（NCT05548088），入组LILRB4阳性R/R AML（M4/M5）患者经氟达拉滨+环磷酰胺清淋后接受递增剂量DE STAR-T细胞输注，监测安全性（CRS、ICANS、不良事件）、扩增（qPCR、流式）、疗效（ORR按CR/MLFS/PR评估）及细胞因子动态；对部分患者骨髓单个核细胞行10x Genomics scRNA-seq分析微环境细胞亚群及T细胞功能差异。
研究结果
Design and preclinical evaluation of nanobody-based dual epitope anti-LILRB4-STAR T cells（基于纳米抗体的双表位抗-LILRB4 STAR-T细胞的设计与临床前评价）：通过噬菌体展示筛选出两株靶向LILRB4不同表位的纳米抗体构建单/双表位STAR-T。体外细胞毒性实验显示双表位STAR-T（DE STAR-T）较单表位STAR-T对MV4-11及低LILRB4表达的KASUMI-1细胞杀伤更强（尤其低效靶比时），刺激后IFN-γ、IL-2分泌更高。APOE与纤维连接蛋白（FN）可与LILRB4结合但不影响DE STAR-T对靶细胞的杀伤。DE STAR-T可有效清除诱导的M-MDSC。流式证实正常人骨髓CD34+HSC极少表达LILRB4，DE STAR-T对其无显著细胞毒性且不引起明显活化。NCG小鼠MV4-11-luc异种移植模型中，DE STAR-T较单表位STAR-T肿瘤控制更优且在外周血中扩增更持久；OCL-AML3-luc模型中也显示肿瘤抑制与生存改善。
Compared with DE CAR-T cells, DE STAR-T cells mediate superior T-cell functions under low-LILRB4-expressing target cell stimulation（与DE CAR-T细胞相比，DE STAR-T细胞在低LILRB4表达靶细胞刺激下介导更强的T细胞功能）：患者原代AML细胞LILRB4表达低于CD123与CLL1。以低LILRB4表达的KASUMI-1为靶细胞，DE STAR-T较四种设计的DE-CAR-T细胞（DE-CAR1~4）具更强杀伤力与更高IFN-γ、IL-2、TNF-α分泌，低抗原刺激下更快分化为效应T细胞。Western blot显示DE STAR-T激活后TCR信号（CD3ζ、PLCγ1、LAT磷酸化及AKT、ERK1/2活化）及抗原刺激后非经典NF-κB（ncNF-κB，RelB/p52核转位）强于DE-CAR-T。MV4-11-luc小鼠模型示DE STAR-T与DE-CAR-T初期均控瘤，但后期DE-CAR-T组部分复发而DE STAR-T组多数维持无瘤。
Patient characteristics（患者基线特征）：2023年5月至2024年6月筛查12例LILRB4阳性R/R AML（均为M4/M5），1例撤回、2例输注前感染死亡，最终9例（中位年龄36岁，7例既往allo-HSCT后复发）接受DE STAR-T输注，其中4例自体来源、5例供者（单倍型）来源，中位转导效率54.75%，剂量1×106~1×107cells/kg。
Treatment（治疗过程）：所有患者接受氟达拉滨（30 mg/m2）联合环磷酰胺（300 mg/m2）三日清淋后输注DE STAR-T，中位血管至输注时间22天。
Safety assessment（安全性评估）：9例发生≥3级不良事件，88.9%为全血细胞减少；3例死于输注后28天内确认感染（菌/真菌/病毒感染）伴重度中性粒细胞缺乏，经安全审查委员会判定非剂量限制毒性（DLT）。6例可评估DLT者无≥3级CRS或ICANS；83.3%（5/6）发生CRS（1例1级、4例2级），均缓解。无ICANS。
Clinical outcomes（临床结局）：6例完成评估者中位随访10.7月，最佳ORR 50.0%（3/6：1例CR伴MRD阳性、1例形态学无白血病状态MLFS伴MRD阳性、1例PR伴MRD阳性），全分析集ORR 33.3%（3/9）。估计1年总生存（OS）率44.4%。响应多见于高剂量（≥6×106cells/kg）且多为供者来源STAR-T组。2例后续行allo-HSCT维持MRD阴性CR＞16月，1例化疗+供者淋巴细胞输注（DLI）获MRD阴性CR维持19月。
STAR-T expansion, changes in LILRB4-positive cells and cytokine secretion（STAR-T扩增、LILRB4阳性细胞变化及细胞因子分泌）：外周血STAR基因拷贝数中位峰值日D7，与LILRB4阳性细胞比例负相关。血浆IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ多在D7~D14达峰与STAR-T扩增同步，D28回落。CD14+单核细胞呈早期耗竭后恢复双相改变。
Single-cell analysis reveals suppressed autologous T-cell function in nonresponder patients（单细胞分析揭示无应答者中存在抑制的自体T细胞功能）：对2例完全缓解（CR）与2例无应答（NR）者治疗前后骨髓行scRNA-seq注释11类细胞群，将单核细胞再分群鉴定M-MDSC亚群高ROS活性且高LILRB4表达。治疗后各组合LILRB4表达下调，但NR组M-MDSC ROS及T细胞抑制能力显著高于CR组。治疗前NR者CD8+T细胞上调抑制分子（MDM2、BAX）而CR者上调活化/杀伤分子（KLRK1、GZMK）；细胞通讯分析示NR组骨髓单核细胞（M-MDSC、Mono2、Mono4）通过LGALS9、MIF等通路更强抑制CD8+T细胞，提示单核细胞介导T细胞功能障碍是NR主因。
讨论与结论总结：AML的CAR-T治疗受限于缺乏特异性靶点与免疫抑制微环境，LILRB4在M4/M5 AML/LSC高表达且HSC不表达故为理想靶点。双表位STAR利用两纳米抗体模拟双靶向设计增强亲和力与防抗原逃逸，临床前优于单表位STAR及双表位CAR-T。首例人体I期试验显示DE STAR-T在重度预治疗、移植后复发的R/R AML具可行性，可扩增并清除LILRB4阳性原始细胞，无严重CRS/ICANS，但伴 prolonged全血细胞减少与感染风险。应答与较高STAR-T扩增量、供者来源产品可能相关。scRNA-seq提示NR者存在单核细胞/M-MDSC介导的自体T细胞功能抑制。局限性为样本量小（n=9），需更大样本多中心试验验证。结论：这项首个人体试验证明靶向LILRB4的双表位STAR-T细胞疗法在R/R单核细胞性AML中具有可行性与治疗潜力，后续需优化患者筛选、感染防控及探索联合策略或供者源通用型产品以提升疗效。
