末端带有茎环结构（stem-loop）的树枝状大分子DNA能够通过荧光共振能量转移（FRET）实现miRNA的定量分析，这种分析基于分子间的邻近效应或局部浓度效应

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Stem-loop-terminated dendrimer DNA enables the ratiometric fluorescent miRNA analysis by fluorescence resonance energy transfer via the proximity/local concentration effect

作者：史颖|胡翠霞|韩继龙|齐彦超|杨静思|张志坤

河北科技大学化学与制药工程学院，石家庄050018，中国

摘要

微小RNA-21（miR-21）是一种短的非编码RNA，可作为癌症、心血管疾病和炎症性疾病的早期诊断生物标志物。因此，开发一种快速、便捷且高度敏感的miR-21检测方法对于通过即时检测实现准确疾病诊断至关重要。本文设计了一种基于茎环结构的荧光DNA树状大分子，由Y-DNA_a和Y-DNA_b组成，利用荧光共振能量转移（FRET）效应来检测miR-21。Y-DNA_a和Y-DNA_b均包含一个树状核心和三个粘性末端，分别用Cy3和Cy5标记。在检测系统中，受限的微环境使miR-21能够作为可重复使用的催化剂，高效地触发Y-DNA_a和Y-DNA_b的催化发夹组装（CHA）反应。同时，由于茎环结构的粘性末端杂交，Y-DNA_a的Cy3与Y-DNA_b的Cy5之间产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该检测系统在0.5至40 nM的范围内表现出线性响应，两个线性区间分别为0–3 nM和3–40 nM，检测限为0.09 nM。此外，我们还使用该传感平台对血清样本中的miR-21进行了检测，加标回收实验的回收率在98.9%至103.1%之间，相对标准偏差低于5.66%，显示出基于核酸的临床诊断的巨大潜力。

引言

微小RNA（miRNA）是一类长度通常为18–25个核苷酸的小型非编码RNA分子[1] [2]。它们是基因表达的关键调节因子，主要通过抑制翻译或降解目标mRNA来发挥作用，常常同时作用于多个mRNA，并在癌症中既可作为致癌基因也可作为肿瘤抑制因子[2] [3]。miRNA的失调与多种疾病有关，包括癌症、脑震荡、帕金森病和传染病[2] [4]。相关研究表明，miR-21在多种恶性肿瘤细胞中高表达，如肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌和前列腺癌[5] [6]。miR-21可作为疾病的早期诊断和治疗生物标志物。因此，开发便捷、快速且敏感的miR-21检测方法对于通过即时检测进行诊断具有重要意义。

传统的miRNA检测方法主要包括Northern印迹、实时聚合酶链反应（RT-PCR）和微阵列[7] [8]。尽管这些方法具有较高的灵敏度和选择性，但由于操作复杂、耗时较长且成本较高，特别是在资源有限的环境中，它们不适用于即时检测。目前，为了满足快速、便捷的即时检测需求，已经开发了等温核酸扩增技术用于高灵敏度的miRNA检测[2] [9] [10]。这些技术包括链置换扩增（SDA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、催化发夹组装（CHA）、滚环扩增（RCA）和环介导的等温扩增（LAMP）[11] [12] [13] [14]。与上述方法相比，CHA策略无需酶参与，操作简单，灵敏度高[15] [16] [17]，因此特别适合在即时检测中使用。CHA基miRNA检测系统作为纳米级生物传感器时，其检测性能主要取决于探针与目标分子之间的有效相互作用概率[18] [19] [20]；通过提高传感器与目标分子之间的相互作用效率和碰撞概率，可以提升检测性能。

核酸具有优异的可编程性，可以构建各种纳米材料结构以增强miRNA检测的碰撞效率[21] [22] [23]。Feng等人设计了一种基于核酸纳米材料的框架，用于加速反应速率并提高活细胞中miRNA检测的动态性能[24]。Xu等人开发了一种四臂纳米探针，利用荧光分子信标在空间限制条件下检测miR-21和miR-155[25]。Wei等人使用脂质界面来增强miRNA与探针之间的相互作用效率[26]。因此，探针与目标分子之间的碰撞概率是决定检测限的关键因素。与单发射荧光传感器相比，比率荧光传感器提供更稳定的信号，并能对环境变化进行内部校正，从而大大降低假阳性结果的风险[27]。荧光共振能量转移（FRET）是比率传感中最常用的机制之一。当供体和受体同时被激发时，供体的发射减弱而受体的发射增强，两个发射峰的强度比提供了对探针浓度和仪器变化具有内在归一化的稳健定量结果[28]。重要的是，比率FRET策略通过这种内置的信号归一化机制扩展了线性检测范围。比率FRET传感器已广泛应用于均匀溶液或平面界面中的miRNA检测[29] [30] [31]；然而，将其整合到基于树状大分子催化发夹组装（CHA）扩增产生的受限纳米空间中的研究尚未报道。这种邻近/局部浓度效应有望进一步提高探针与目标之间的碰撞效率，从而在保持比率读数自校正优势的同时提高检测灵敏度。在本研究中，我们结合了树状大分子DNA的邻近效应和催化发夹组装（CHA）策略，通过荧光共振能量转移同时提高miRNA检测的灵敏度。具体而言，设计了具有末端茎环结构的新型荧光树状大分子DNA（Y-DNA_a和Y-DNA_b，如图1a所示。Y-DNA_a（Ya）和Y-DNA_b的3′端分别具有用于锚定Cy3修饰的发夹（H1）和Cy5修饰的发夹（H2）的识别尾部（图1b）。如图1c所示的检测机制，miR-21触发Ya中的环片段打开，促使Ya和Yb组装并释放miR-21。此外，miR-21还诱导催化发夹组装（CHA）反应形成大纳米孔。在此过程中，Cy3和Cy5相互靠近，由于FRET效应，Cy5的荧光增强而Cy3的荧光减弱。根据这一机制，我们构建了一个基于荧光响应的检测系统来有效检测miR-21（图1d）。该方法实现了快速、高效的miRNA检测，具有显著的疾病诊断潜力。

章节片段

材料与设备

用于制备Ya和Yb的寡核苷酸序列（表1）由Sangon Biotech有限公司（中国上海）合成，并通过高效液相色谱（HPLC）纯化。琼脂糖（BIOWEST，西班牙，BY-R0100）、TAE缓冲液（50×，BL533A）、DNA梯度（D776022）、DNA加载缓冲液（6×，D917746）和溴化乙锭（EB，E854573）用于凝胶电泳实验。氯化钠（NaCl，99.5%，S805275）及其他化学品均为分析级。

具有末端茎环结构的荧光树状大分子DNA的制备

在本研究中，两种类型的树状大分子DNA（Y形分支DNA，Ya和Yb）由三种相应的单链DNA（ssDNA）组成。通过合理的序列设计，ssDNA包含用于构建Y-DNA的分子间结合区域，发夹结构的粘性末端分别修饰了荧光染料Cy3和Cy5（图1a）。在miR-21存在的情况下，Ya的发夹结构打开并与Yb的发夹结构杂交，从而引发催化发夹反应

结论

总之，本研究构建了一种基于树状大分子DNA的传感平台，利用FRET策略检测miR-21作为疾病诊断的生物标志物。在检测过程中，设计了具有三个捕获位点的树状大分子DNA，以产生邻近/局部浓度效应，增强目标分子与探针之间的相互作用。当引入miR-21后，Ya和Yb（分别含有Cy3和Cy5修饰的发夹）与DNA结合。由此形成

作者贡献声明

史颖：研究、方法学设计、验证、初稿撰写。胡翠霞：撰写、审稿与编辑。韩继龙：撰写、审稿与编辑。齐彦超：方法学设计、验证、撰写、审稿与编辑。杨静思：方法学设计、验证、撰写、审稿与编辑。张志坤：概念构思、形式分析、监督、初稿撰写、审稿与编辑。

资助

本研究得到了以下资助：河北省自然科学基金（H2022206176）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。