基于CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统与滚环扩增(Rolling Circle Amplification, RCA)辅助的比色法适配体传感器用于铅(II)离子(Pb2+)检测及其在食品与健康安全监控中的应用

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A CRISPR-driven aptasensor for colorimetric monitoring of lead (II) ion assisted by rolling circle amplification process: Effective in controlling food and health safety

摘要：本研究首次将成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)系统、滚环扩增(Rolling Circle Amplification, RCA)过程以及金纳米粒子(Gold Nanoparticles, AuNPs)的催化活性相整合，建立了一种高效的比色适配体传感器(colorimetric aptasensor)，用于高灵敏度检测铅(II)离子(Pb2+)。当样品中存在Pb2+时，其使CRISPR系统失活，无法切割负载于磁流液(Ferrofluids, FFDs)表面的互补链(Complementary Sequence, CS)，并促进RCA产物形成；RCA产物包裹AuNPs后经磁场分离去除FFDs，上清液中加入4-硝基苯酚(4-nitrophenol, 4-NP)后因AuNPs未被移除而保持黄色。反之，在无Pb2+条件下，CRISPR-Cas12a被激活并发生反式切割(trans-cleavage)降解CS及RCA模板，无大量DNA结构生成故无法截留AuNPs，AuNPs随FFDs被磁分离除去，上清液中4-NP在缺失催化条件下不被还原，溶液变为无色。该比色适配体传感器对Pb2+的检测线性范围分别为0.1 pM–20 nM和20 nM–800 nM，检出限(Limit of Detection, LOD)达0.024 pM，且可成功定量生物样品、化妆品及海产品中的Pb2+含量。

论文解读：CRISPR与RCA耦合的比色适配体传感器高灵敏检测铅(II)离子

一、研究背景与意义

铅(II)离子(Pb²⁺)是重要的环境持久性重金属污染物，无法被生物体代谢，可在体内蓄积并置换必需金属离子、诱导氧化应激及抑制酶活性，尤其对儿童神经系统发育造成严重损害，亦可引起成人肾功能障碍、高血压及致癌风险。世界卫生组织(WHO)规定饮用水中Pb²⁺的允许浓度为5 μg·L^?1。传统仪器检测方法如电感耦合等离子体质谱(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS)和原子吸收光谱(Atomic Absorption Spectrometry, AAS)虽准确但依赖昂贵设备与专业人员，无法实现现场可视化检测。核酸适配体(aptamer)系经指数富集配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)筛选出的单链DNA/RNA，对Pb²⁺具有高特异性亲和——Pb²⁺适配体富含鸟嘌呤，可形成G-四链体(G-quadruplex)结构，结合常数达1.08×10⁶M^?1。将适配体传感与CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性、滚环扩增(RCA)信号放大及金纳米粒子(AuNPs)催化比色相结合，有望突破现有便携检测瓶颈。研究人员由Mahshid Olfati Sumar、Fatemeh Mohammadi、Zahra Khoshbin、Fatemeh Abbasi Ghaeni、Khalil Abnous及Seyed Mohammad Taghdisi（来自伊朗马什哈德医科大学靶向药物递送研究中心）开展的此项研究，旨在构建一种无仪器、裸眼可读的高灵敏Pb²⁺比色适配体传感器，发表于《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用羧基化磁流液(Ferrofluids, FFDs，简称MB)偶联氨基修饰互补链(CS)作为磁性载体；设计Pb²⁺特异性DNA适配体与CRISPR-Cas12a的crRNA杂交以调控Cas12a反式切割活性；在有CS环状模板及Phi29 DNA聚合酶条件下进行RCA扩增；利用长链RCA产物截留AuNPs，通过外置磁场分离FFDs，依据4-硝基苯酚(4-NP)是否被残留AuNPs催化还原呈现黄色或无色判读结果；以不同浓度Pb²⁺标准品绘制校准曲线，并以加标回收法验证人血清、口红、虾及鱼子酱实际样品的适用性。

三、研究结果

Detection strategy of aptasensor（检测策略）

研究人员阐明：无Pb²⁺时，适配体与crRNA杂交激活CRISPR-Cas12a，Cas12a反式切割MB表面CS及RCA模板，阻止RCA发生，体系无大分子DNA截留AuNPs，AuNPs随MB磁分离被去除，上清加4-NP因缺AuNPs催化保持无色；有Pb²⁺时，适配体与Pb²⁺结合形成G-四链体并从crRNA解离，Cas12a未被激活故不切割CS，CS引发RCA生成大量长链DNA产物包裹AuNPs，磁分离去除MB后AuNPs留于上清，催化4-NP显黄色。颜色变化与Pb²⁺存在与否直接对应。

Materials（材料）

研究人员使用商业化合成适配体及寡核苷酸、Cas12a(Cpf1)蛋白、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶、dNTPs及羧基化FFDs等完成体系构建，具体序列与试剂来源文中Table S1及对应厂商说明。

Conclusion（结论——翻译研究结论部分）

许多常见消费品（如口红）及海产品（如虾和鱼子酱）易受Pb²⁺污染，因此开发精确、快速且无需仪器的技术在人血清等生物标本中检测该金属离子至关重要。本研究构建了一种高灵敏度比色适配体传感器，用于检测实际样品（人血清、口红、虾及鱼子酱）中的Pb²⁺。其传感机制依赖于Pb²⁺适配体与CRISPR-Cas12a系统的相互作用来调控RCA过程及AuNPs的截留，进而通过比色变化实现检测。该传感器对Pb²⁺表现出两个线性响应区间（0.1 pM–20 nM与20 nM–800 nM），检出限低至0.024 pM，在实际基质中具有良好的回收率与选择性，不受常见干扰金属离子影响。此智能设计为Pb²⁺现场筛查提供了便携平台，并可拓展至其他靶标分析物检测。

四、总结与讨论

研究人员通过巧妙利用Pb²⁺适配体对Cas12a反式切割活性的"开关"调控作用，将目标识别事件转化为RCA核酸放大信号差异，再经RCA产物对AuNPs的物理包埋与磁分离实现裸眼比色读出。该方法避免了传统大型仪器的限制，LOD(0.024 pM)远低于WHO饮用水限值对应浓度，且在实际复杂基质中表现可靠。引入磁流液(FFDs)提高了分离效率与信噪比。该工作证明了CRISPR-Cas12a耦合适配体识别与等温扩增可用于重金属离子的超灵敏便携检测，为食品安全及健康监护领域的现场快检提供了可扩展的技术范式。