绘制塑造湿地甲烷排放的土壤微生物组功能图谱

《mSystems》：Mapping the soil microbiome functions shaping wetland methane emissions

淡水湿地虽然仅占地球陆地面积的8%，却是全球甲烷(CH4)排放的首要贡献者。然而，导致湿地土壤产生甲烷排放的微生物及过程仍未得到充分了解。在一项为期五年的研究中，研究人员调查了美国甲烷排放量最高的湿地之一的700多个样本的微生物类群及原位甲烷测量数据。研究人员构建了包含2,502个宏基因组组装基因组(MAGs)的目录，其中采样的70个细菌和古菌门中有超过一半含有新型谱系。将这些数据与133个土壤宏转录组整合后，提供了湿地土壤时空梯度下生物地球化学特化和多功能性的基因组解析视图。厘米级的深度差异最能解释微生物群落结构和转录功能的模式，其解释力强于土地覆盖或时间信息。此外，虽然长期淹水重组了土壤氧化还原(redox)状态，但这种扰动未能重新配置甲烷循环微生物的转录谱，这与理论上对水文扰动预期的反应相反。结合深度分辨的甲烷测量进行共表达分析，揭示了最能预测甲烷热点的代谢和营养结构。在此汇编的生物地球化学分类的土壤来源基因组上绘制时空转录图谱，有助于理清促成湿地甲烷产生的微生物碳、能量和养分处理过程。

研究背景与意义

湿地作为典型的淹水土壤，富含有机质且孔隙水中氧气浓度极低。这种缺氧环境导致土壤有机质的微生物厌氧分解，进而产生大量的生物源甲烷(CH₄)。因此，湿地土壤是这种强效温室气体最大且变化最大的来源，约占全球年排放量的三分之一。尽管在识别湿地微生物群落、代谢途径以及调控土壤有机碳转化为CH₄的环境控制因素方面已取得实质性进展，但在将基因组解析的微生物特征与不同时空尺度下的过程级甲烷通量联系起来方面仍存在不确定性。这一知识缺口阻碍了将微生物过程纳入土地表面和生物地球化学模型，从而影响了湿地温室气体通量的准确管理和预测。

过去十年的宏基因组测序虽描述了多种生境中与CH₄产生相关的微生物群落成员和功能，但相较于废水、反刍动物或地下栖息地等系统，湿地土壤在微生物基因组采样方面仍相对未被充分探索。现有的少数针对淡水湿地的基因组解析研究几乎都集中在北方泥炭地的有机土壤中，而作为CH₄贡献最高的湿地类型——温带和热带沼泽，迄今为止仅有极少数的基因组解析研究。为了弥补这一空白，研究人员在美国俄亥俄州伊利湖畔选择了Old Woman Creek (OWC)湿地作为模型。该湿地是美国AmeriFlux网络中甲烷排放量最高的站点，其CH₄通量超过同类气候区湿地中位数的10倍以上，且极易受到气候变化引起的水位波动影响。本研究旨在通过基因组解析的多组学框架，解析温带淡水湿地中产生甲烷的微生物成员、表达代谢及其相互作用，从而扩展甲烷循环谱系的基因组代表性，并将其微生物活性与群落相互作用和甲烷浓度联系起来。

主要技术方法

研究人员在2013年至2018年间，对OWC湿地进行了长期的月度采样。样本涵盖了四种土地覆盖类型，包括挺水植被（如香蒲属 Typha 和莲属 Nelumbo）、开阔水域和临时泥滩。在深度梯度上，研究人员采集了地表至地下30厘米的土壤芯样，并按5厘米间隔进行分层处理，最终获得了705份用于土壤地球化学、代谢物和微生物分析的样品。

在技术路线上，研究人员首先对671份土壤样本进行了16S rRNA扩增子测序以鉴定产甲烷菌群落成员，并从中筛选出42份样本进行深度宏基因组测序，总计产生了3.1 Tbp的数据，用于重建微生物基因组。同时，研究人员对133份具有配对地球化学数据的土壤样本进行了总计2.7 Tbp的宏转录组测序，以绘制哪些微生物基因组招募了转录本以及哪些代谢功能在不同站点、深度、季节和年份中得到了表达。此外，研究还结合了透析窥视器测量的孔隙水CO₂和CH₄浓度数据，以及表面箱式通量和涡度协方差技术测定的场地尺度通量数据，构建了加权基因共表达网络，以识别与土壤CH₄浓度最具预测性的微生物类群和代谢模块。

研究结果

从湿地土壤中采样微生物

通过对42个选定样本的深度宏基因组测序和多种组装分箱方法的靶向回收，研究人员最终获得了3,217个基因组代表，其中包含2,502个高质量和中高质量的宏基因组组装基因组(MAGs)。这些MAGs涵盖了60个细菌门和10个古菌门，其中包括85个产甲烷相关代表。值得注意的是，超过一半的采样细菌和古菌门包含了新的谱系。在随后的宏转录组分析中，133个样本中约有75%的重建基因组成功招募了转录本，表明这些微生物在湿地环境中具有高度的转录活性。

揭示湿地土壤中数千个转录基因组

研究重建的MAGs中包含了许多在属级或更高级别上新采样的谱系，例如未命名的纲、目、科和属。在这些转录活跃的基因组中，绝大多数属于分类学上鲜为人知的类群。这一发现揭示了我们对积极塑造湿地生物地球化学过程的生物体仍存在巨大的认知鸿沟。

将转录的生物地球化学功能与微生物分类学联系起来

研究人员评估了1,948个招募到转录本的MAGs，分析了其与14种生物地球化学过程相关的表达基因含量。分析结果显示，尽管好氧和微好氧代谢的编码能力在湿地谱系中分布最广，但在转录水平上，厌氧代谢（如专性发酵、铁还原和氮还原）的基因转录检测频率远高于好氧代谢。这表明转录谱捕捉到了仅凭基因组含量无法显现的环境响应代谢活动，凸显了基于表达的剖析对于揭示活跃微生物过程的重要性。在门类水平上，不同 phylum 展现出不同的功能特化，例如 Thermoproteota 或 Halobacteriota 门的转录主要由专性发酵或产甲烷作用主导，而 Pseudomonadota 和 Acidobacteriota 门则转录了广泛的性状，反映了显著的代谢多功能性。

确定塑造湿地微生物组结构和功能的主要驱动因素

通过评估17个空间、时间和地球化学因素的影响，研究发现无论测量何种微生物组属性，深度及深度相关的地球化学因素（如土壤Fe(II)和阳离子交换量CEC）都是湿地土壤微生物组结构和功能的最佳预测因子，其解释力强于土地覆盖类型的差异。这些化学和物理土壤属性在塑造表达的功能类群方面发挥了更直接的作用，解释了40%至50%的变异，几乎是系统型数据变异解释量的两倍。

揭示古菌在碳循环中新定义的角色

研究广泛恢复了298个古菌MAGs，跨越10个门。传统上，古菌在湿地中的作用主要被视为产甲烷或代谢其他单碳(C1)化合物。然而，本研究推导了一套基于基因的规则集，将这些基因组分配到四个碳分解营养级中：聚合物水解、糖氧化、有机酸和氮转化以及C1代谢。研究发现，系统发育多样的古菌谱系表达了水解植物聚合物成分的基因，为第二营养级生物提供了糖和寡聚体或单体。此外，还发现了利用至少三种糖底物的糖利用专性古菌。这些发现证明，古菌在初级碳降解中的作用常被忽视，它们实际上在土壤碳周转中占据了多个碳营养级，贡献远比以前认识到的更广泛。

在C1代谢方面，近三分之一的古菌基因组被归类为产甲烷菌，代表了四个门。研究发现了85个产甲烷菌MAGs，涵盖10个科和20个属，其中8个是本研究新发现的属。在代谢重建方面，乙酸营养型产甲烷作用仅限于 Methanothrix 及其近亲成员。野外数据证实，由于在这些湿地土壤典型的低乙酸浓度下具有更高效的底物获取能力，专性乙酸营养的 Methanothrix 在原位条件下优于兼性乙酸裂解菌 Methanosarcina。在产甲烷途径中，专性氢营养型是52%的MAGs中最普遍转录的途径，其中最活跃的两个古菌被鉴定为专性氢营养型。此外，研究强调了甲基营养型途径被低估的重要性，25%的湿地产甲烷菌MAGs表达了甲基营养型产甲烷基因，且经常检测到甲基氮、硫和氧化合物，这表明甲基营养型产甲烷可能是湿地生态系统中广泛存在且未被充分重视的甲烷来源。

甲烷循环类群在多年深度梯度上的时间稳定性

对2018年夏季每月采集的淹水泥滩样本进行的基于基因组的甲烷循环转录模式分析，揭示了产甲烷菌和甲烷氧化菌的时空生态位和可能的深度定义生态型。研究发现六个核心产甲烷菌在所有土壤深度和时间点均具有高水平的均值转录。其余CH₄循环成员则局限于特定的土壤深度，形成了在这个夏季持续存在的共表达分支。具体而言，表层土壤中乙酸营养型和好氧甲烷氧化菌的比例富集更高，而中层和深层土壤则包含了厌氧甲烷氧化菌 Methanoperedens 基因组，以及比例更高的氢营养型和甲基利用型产甲烷菌。

随后，研究人员比较了2015年8月和2018年8月同一泥滩的样本。在此期间，湿地发生淹水，2015年暴露的泥滩在2018年被5.3英尺的淡水淹没。理论预期淹水会降低溶解氧(DO)浓度并广泛增加群落中的产甲烷菌表达，尤其是表层土壤。匹配预期的是，淹水后表层土壤的DO降至检测限以下。然而与预期相反，90%的产甲烷菌和好氧甲烷氧化菌（如 Methylococcaceae, Methylomonadaceae）MAGs在受洪水重构的表层土壤中的平均基因组转录没有显著变化。这可能是因为栖息在这些经常浸水和排水的表层土壤中的产甲烷菌，可能已经栖身于缺氧微位点（如生物膜或土壤团聚体）中受到了庇护。

共表达网络揭示调节土壤温室气体的关键谱系

通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)，研究人员在133个宏转录组样本中识别出由具有共享转录模式的基因组组成的七个模块。其中两个模块预测了土壤孔隙水CH₄浓度：与表层土壤相关的青色模块与土壤CH₄浓度呈负相关，而与深层土壤相关的棕色模块则呈正相关。这两个模块分别包含551个和372个MAGs。通过对这些预测性属的转录碳和能量功能基因内容进行提炼，研究人员描绘了促成这些深度界定分区中CH₄浓度的营养配置。

与基于分类学的分析一致，关键生物地球化学过程（如铁还原、微好氧呼吸和甲烷产生）在这些预测模块的不同深度均有转录。铁还原菌 Zikibacteria 和专性发酵菌 Syntrophales 是两个深度分区中的重要预测因子。然而，不同的微生物谱系通常负责在不同深度介导相同的功能。例如，微好氧呼吸在表层土壤涉及 Bacteroidales，而在深层土壤中则由 Anaerolineales 和 Sedimentisphaerales 发挥类似作用。此外，反硝化作用和低亲和力细胞色素氧化酶的表达等适应较高氧浓度的性状仅出现在表层模块中。好氧甲烷氧化作用的转录证据也专属存在于表层模块，这很可能解释了青色模块与表层土壤CH₄浓度之间的负相关性。这些基于转录组的过程观察揭示了湿地土壤中表达的生物地球化学相互作用，表明土壤CH₄浓度似乎是微生物组的涌现属性，不仅仅由单个产甲烷菌驱动，而是由微生物类群间复杂的、深度解析的相互作用所驱动。

讨论与结论

深度结构的微生物组与冗余性塑造湿地稳定性

研究表明，深度是构建淡水湿地土壤中微生物组成和转录活性的主导轴。在时空梯度上，微生物群落和生物地球化学功能呈垂直分层分布，功能类群始终与深度界定的氧化还原和地球化学剖面保持一致。诸如产甲烷、铁还原和发酵等性状在同一深度层内由系统发育多样的生物体表达，表明存在高度的转录冗余。这种冗余无论是在谱系内部还是跨谱系之间，都可能缓冲了甲烷循环功能免受环境波动的影响，并有助于CH₄产生的长期稳定性。研究不仅证明了大量回收的古菌和细菌基因组中存在广泛的转录活性，还证明了这种活性与高功能冗余相结合，使得成功的缓解策略必须超越单一目标的干预措施，并将土壤微生物组的深度解析、群落水平架构考虑在内。

扩展甲烷范式：超越经典底物和谱系

本研究通过识别替代代谢途径和未被重视的贡献者，扩展了甲烷循环的框架。尽管乙酸营养型和氢营养型产甲烷作用主导着传统模型，但研究中近四分之一的转录活跃产甲烷菌表达了利用甲基化化合物的基因。这些数据表明，CH₄的产生不仅由乙酸或氢气提供燃料，还来源于甲基化的含氮、含硫和含氧化合物。此外，孔隙水中的甲烷浓度通过涉及铁还原菌、专性发酵菌、甲烷氧化菌和微好氧异养菌的共表达网络比仅靠产甲烷菌能更准确地预测。这些发现强调需要将甲烷视为综合的、特定深度的微生物群落的涌现属性。

对基于氧化还原的地球系统模型的启示

基于基因组解析的转录谱显示，尽管存在重大的水文和氧化还原扰动，湿地土壤深度的甲烷循环活性在季节和多年尺度上具有稳定性。产甲烷菌的转录在很大程度上对土壤氧浓度变化的反应不敏感。这些发现挑战了长期以来认为氧气是湿地CH₄产生主要调节因子的范式。产甲烷菌转录本在可检测氧气的表层土壤中持续存在，并且在因洪水引起的5.3英尺氧化还原转变后没有显著变化，而好氧甲烷氧化菌即使在缺氧条件下仍保持活性。这些模式可能反映了微尺度的氧化还原异质性，使得微生物能够在低氧条件下持续存在。研究结果揭示了在地球系统模型中使用粗略的氧化还原指标（如溶解氧）的局限性，并强调了需要更精细、空间明确的观测。将量身定制的生物地球化学测量和基因组信息指标结合起来，将改善湿地中甲烷循环异质性的表征。

结论

本研究采用全面的湿地土壤多组学调查，前所未有地揭示了支撑生物地球化学循环的微生物组结构和功能属性。这种方法有助于将土壤微生物组研究从历史上的环境输入和输出的“黑箱”中解放出来，揭示了微生物群落组成和基因表达如何响应深度和地球化学梯度。为了解释这种复杂性，研究人员开发了基于基因的规则来分类微生物能量代谢和碳营养级，从而能够解析甲烷循环群落的涌现属性。该框架揭示了古菌谱系在碳分解中以前未被认识的作用，展示了产甲烷菌的底物多样性和氧化还原恢复力，并证明了稳定的、深度分层的共表达模式对土壤CH_{4浓度具有预测性。总之，这些见解为将微生物活动嵌入地球系统模型以及指导旨在减轻湿地甲烷排放的微生物组知情策略奠定了机制基础。}