一种用于检测DON（二氧萘）的新型分子印迹电化学细胞传感器

《Bioelectrochemistry》：A novel molecularly imprinted electrochemical cellular sensor for DON detection

姜东雷|徐一乐|王楠伟|毛立伟|姜慧|王立峰

南京财经大学食品科学与工程学院，现代粮食流通与安全协同创新中心，粮油质量控制与加工重点实验室，江苏省南京市210023，中国

摘要

本研究开发了一种新型分子印迹电化学传感器，用于超灵敏检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）。以邻苯二胺（o-phenylenediamine）作为功能单体，Caspase-3作为模板分子，通过电聚合技术在丝印电极上制备了分子印迹聚合物薄膜。洗脱后，将该传感器集成到三电极系统中。当DON暴露时，来自HepG2细胞的Caspase-3会特异性结合到印迹空腔中，从而改变电化学指示剂[Fe(CN)?]??/3?的电流响应。利用差分脉冲伏安法（DPV）检测发现，电流峰值与DON浓度在0.2至100 pg/mL范围内呈线性关系，检测限为0.193 pg/mL（R2 = 0.9977）。这项工作为食品中DON的快速检测提供了一种新方法，并扩展了分子印迹技术在霉菌毒素分析中的应用。

引言

霉菌毒素是由多种生长在食品上的真菌产生的天然有毒次级代谢产物[1]。在适宜条件下（尤其是高温和高湿度），产霉菌毒素的真菌会在食品上繁殖，并通过污染食品进入食物链，从而增加对人类和动物的健康风险。即使食品中存在少量霉菌毒素，也可能对人体和动物健康产生不良影响[2]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），也称为呕吐毒素，属于三萜类霉菌毒素家族，常见于谷物中，具有细胞毒性、免疫毒性和生殖毒性[3]。由于其稳定的物理和化学性质，霉菌毒素即使在高温下也难以分解[4]。因此，有必要开发一种可靠的分析方法，以灵敏有效的方式检测食品中的DON毒素，从而适当保护人类健康。

细胞凋亡（apoptosis），也称为程序性细胞死亡，是一种高度调控的生理过程，对维持组织内的细胞稳态至关重要[5]。在此过程中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）作为关键执行酶，催化多种关键细胞蛋白的特异性切割。由于Caspase-3同时参与内在和外在凋亡途径，它被广泛认为是活细胞和裂解物中凋亡的确定性生物标志物[6]。因此，Caspase-3的表达可作为DON诱导的细胞毒性的确定性和早期指标。除了细胞内靶标外，外化的膜标志物（如磷脂酰丝氨酸（PS）也成为仿生传感中的关键靶标。最近，针对PS的定向分子印迹策略为区分细胞状态提供了强大工具[7]，并实现了液体活检中的高效外泌体捕获[8]。基于这一更广泛的凋亡监测背景，本研究聚焦于细胞内的执行途径。通过利用Caspase-3作为生物标志物，将亚致死剂量的DON暴露转化为可量化的蛋白质表达。有效监测这一活性有助于阐明霉菌毒素的细胞毒性，为霉菌毒素的筛查和毒性评估提供了一种基于效应的强大方法。

迄今为止，已经开发出多种具有高准确性和精确度的可靠分析方法来检测霉菌毒素。传统的仪器技术，如液相色谱-串联质谱（LC-MS）[9]和薄层色谱（TLC）[10]，因其高准确性而被广泛用于霉菌毒素的检测。然而，这些方法需要昂贵的仪器和复杂的样品预处理程序，因此不便于在紧急情况下进行现场和实时检测。电化学传感器的构建方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性好和稳定性强的优点[11]。它在检测低水平目标物质方面显示出巨大潜力，目前正被用于霉菌毒素的检测[12]。从根本上说，电化学生物传感器通过将生物识别元件与电子转换器结合，将生化结合事件有效转化为与目标分析物浓度严格成比例的可测量电信号[13]。

分子印迹聚合物（MIPs）通常被认为是电化学传感器中最有效的识别元件之一[14]，由于其多功能性和广泛应用，MIPs在分析科学领域受到了广泛关注[15]。MIPs是通过在模板分子周围聚合功能单体来合成的。模板去除后，会生成定制的3D空腔。这些空腔由功能基团的特定空间排列控制，可作为人工受体选择性地识别和重新结合目标分子，从而提供高度选择性和灵敏的分析平台[16]。例如，Fu等人最近开发了一种创新的夹心结构MIP电化学传感器，用于超灵敏检测食品过敏原，检测限低至3.0 fg/mL[17]。与天然生物受体相比，MIPs具有显著优势，包括更好的稳定性、更简单的制备过程和更低的成本[18]。此外，先进MIP材料的合理设计，特别是近期向绿色和高效印迹架构的转变，显著拓宽了其在实际传感应用中的潜力[19]。特别是原位电聚合技术非常适用于MIP的制备，因为它可以快速在转换器表面沉积一层厚度可控的聚合物薄膜。聚（邻苯二胺）（POPD）是用于此目的的典型基质。该聚合物含有吡嗪和吩嗪环，可通过阳极氧化轻松沉积在多种导电基底上[20]。它通过静电、氢键和其他非共价相互作用结合多种分析物的能力大大增强了其电催化性能[21]。在本研究中，电聚合是在丝印碳电极（SPCEs）上进行的。通过将工作电极、参比电极和对电极集成在单个紧凑型基底上，SPCEs非常适合微量分析，同时具有低成本、微型化、便携性和分析灵活性等固有优势[16]。

因此，本研究利用了DON对HepG2细胞的剂量依赖性凋亡效应。由于Caspase-3在凋亡途径中起着关键和普遍的执行蛋白作用，其表达水平直接反映了DON诱导的细胞毒性程度。通过将这种生物响应与经过高度选择性分子印迹聚合物（POPD-MIP）修饰的丝印电极结合，产生了空间位阻，从而直接降低了[Fe(CN)?]??/3?探针的电化学电流响应。因此，构建了一种用于DON检测和分析的新型分子印迹细胞传感器。该传感器在检测低水平DON方面显示出巨大潜力，为食品和谷物中霉菌毒素DON的识别提供了新方法，并为专门DON传感设备的开发指明了新的研究方向。

章节片段

材料与设备

DON标准品购自上海阿拉丁生化科技有限公司；HepG2细胞由中国科学院细胞库提供；Caspase-3蛋白（人源）购自上海昊源生物医学科技有限公司；邻苯二胺、聚乙二醇二丙烯酸酯和偶氮异丁腈购自上海阿拉丁生化科技有限公司；SPCE购自Metrohm DropSens

分子印迹细胞电化学生物传感器的结构和工作原理

分子印迹细胞的电化学生物传感器的制备过程和工作原理如图1所示。首先通过超声混合OPD（功能单体）、Caspase-3（模板分子）、PEGDA（交联剂）和AIBN（引发剂）来制备MIPs，然后通过循环伏安法直接将其电聚合到丝印碳电极（SPCE）表面，形成坚固的印迹层。

结论

本研究构建了一种用于检测呕吐毒素（DON）的新型分子印迹电化学细胞传感器。以邻苯二胺（OPD）作为功能单体，使用Caspase-3作为模板分子，通过CV方法将聚合物电聚合到电极表面，形成分子印迹聚合物层。洗脱模板分子后，得到了用于检测DON的新型分子印迹细胞电化学传感器。

CRediT作者贡献声明

姜东雷：撰写 – 审稿与编辑，资金获取，概念构思。徐一乐：撰写 – 初稿撰写，数据管理。王楠伟：撰写 – 审稿与编辑。毛立伟：验证，资源准备。姜慧：撰写 – 审稿与编辑，可视化。王立峰：监督，软件开发，资源协调，方法学设计，实验实施，数据分析，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国江苏省现代农业重点项目[BE2022317]、国家自然科学基金[编号32172297、32472430]、江苏省高等教育机构优先学术发展计划（PAPD）资助项目、国家市场监督管理总局科技创新人才计划[QNBJ202328]以及江苏省高等教育机构优先学术发展计划[23KJB610009]的支持。