《Current Research in Food Science》：Toxin gene profiles, antibiotic resistance, and genetic diversity of Clostridium perfringens from food-producing animals: a whole-genome sequencing study with implications for food safety
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产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种重要的人兽共患食源性病原体。为系统评估食用动物在食品生产链早期作为产气荚膜梭菌储库的潜在风险，研究人员对中国不同地区猪、鸡、牛、鸭和鹅中分离的91株临床产气荚膜梭菌进行了全基因组测序（WGS）
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种重要的人兽共患食源性病原体。为系统评估食用动物在食品生产链早期作为产气荚膜梭菌储库的潜在风险，研究人员对中国不同地区猪、鸡、牛、鸭和鹅中分离的91株临床产气荚膜梭菌进行了全基因组测序（WGS）和表型分析。结果显示，分离株携带丰富的毒素基因，71.43%（65/91）携带大于或等于10个毒素基因。除经典A型外，引起动物肠毒血症的C型在猪中最为常见（45.76%）。值得注意的是，通常与禽类坏死性肠炎相关的坏死性肠炎B样（NetB）毒素也在牛和鹅分离株中检出，提示毒素类型的潜在跨宿主传播。抗菌药物敏感性试验显示严重的耐药情况，尤其是猪源分离株，其对克林霉素、青霉素和四环素耐药率最高，且广泛存在多重耐药（MDR）。基因组分析进一步鉴定出14种抗菌药物耐药（AMR）基因。四环素耐药基因tetA(P)携带率极高，达94.51%，且AMR基因在猪源分离株中富集最多。多位点序列分型（MLST）鉴定出59个序列型（STs），其中42个为新发现，显示出高遗传多样性。主要克隆复合体（CCs）显示出一定的宿主和地理聚类。此外，虽然限制性修饰（RM）系统存在于所有分离株中，但其他防御系统（如CRISPR-Cas）的分布呈菌株特异性。本研究表明，来自中国食用动物的产气荚膜梭菌具有高毒力、广泛抗菌药物耐药性和高遗传多样性的特征。研究强调，猪可能是毒力MDR分离株的关键储库和进化枢纽，对食品安全和公共卫生构成持续威胁，并强调了加强农场层面监测的必要性。
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是重要的人兽共患食源性病原体，可引起人类食物中毒、气性坏疽及动物坏死性肠炎等疾病，其致病性依赖于超过20种蛋白毒素，并根据六种主要毒素（alpha毒素plc、beta毒素cpb、epsilon毒素etx、iota毒素iap/ibp、产气荚膜梭菌肠毒素cpe、坏死性肠炎B样毒素netB）分为A-G型。该菌因能形成芽孢而广泛存在于环境和食物中，人类食用受污染动物源性食品后，病原菌可在肠道快速增殖并分泌大量毒素，导致肠道感染。抗生素的长期使用导致抗菌药物耐药性（AMR）日益严重，全球畜牧业消耗大量抗生素，动物源成为耐药基因（ARGs）的重要储库。尽管部分国家已禁止抗生素作为饲料添加剂，但产气荚膜梭菌引起的动物疾病发病率仍呈上升趋势。全基因组测序（WGS）和基于WGS的多位点序列分型（MLST）在流行病学调查和细菌溯源中广泛应用，但对中国多省份、多种食用动物来源产气荚膜梭菌的种群基因组特征研究仍不充分。因此，本研究对来自中国不同地区食用动物的产气荚膜梭菌分离株进行系统基因组分析，以揭示其毒素、耐药性和防御系统相关遗传标记，为食品安全和公共卫生风险评估提供数据支持。研究人员通过全基因组测序和表型分析，对91株来自猪、鸡、牛、鸭、鹅的产气荚膜梭菌进行了系统研究，发现分离株具有高毒力、广泛耐药性和高遗传多样性的特征，猪可能是毒力多重耐药克隆的关键储库和进化枢纽，对食品安全和公共卫生构成持续威胁。该研究发表在《Current Research in Food Science》。
关键技术方法：样本队列来源于2024-2025年中国8个主要畜牧省份的22个城市/县，从349份样品（内脏、粪便、肛拭子）中分离91株产气荚膜梭菌，其中猪源59株、鸡源17株、牛源7株、鹅源5株、鸭源3株。主要技术方法包括：全基因组测序（Illumina NovaSeq Xplus，150bp双端读长，最低150×覆盖度）；基因组组装（SPAdes）和质量评估（CheckM）；毒素基因鉴定（聚合酶链反应PCR检测六种主要毒素基因及毒力因子数据库VFDB分析）；抗菌药物耐药基因鉴定（基因组流行病学中心CGE数据库）；细菌防御系统分析（DefenseFinder）；抗菌药物敏感性试验（微量肉汤稀释法，8种抗生素，参考临床和实验室标准协会CLSI标准）；多位点序列分型（MLST基于8个管家基因colA、groEL、sodA、plc、gyrB、sigK、pgk、nadA，新等位基因和序列型提交PubMLST数据库）；系统发育分析（Parsnp和iTOL平台）。
研究结果：
3.1 产气荚膜梭菌分离株携带高丰度毒素基因：通过毒素基因分析（PCR和VFDB），71.43%（65/91）分离株携带≥10个毒素基因。除A型（52.75%）外，引起动物肠毒血症的C型在猪中优势（45.76%），且通常与禽类坏死性肠炎相关的NetB毒素在牛和鹅中检出，提示毒素类型的跨宿主传播。所有分离株均携带alpha毒素基因plc，cloSI、colA、nagI基因检出率98.90%，nagH、nanH基因检出率97.80%，cpb2基因检出率60.44%。牛源HLBR2株携带15个毒力基因（包括cpb和etx），为最高载量。
3.2 产气荚膜梭菌分离株表现出广泛抗菌药物耐药性：药敏试验（微量肉汤稀释法）显示对克林霉素（42.86%）、青霉素（38.46%）、四环素（36.26%）耐药率高，17.78%为多重耐药（MDR），最常见耐药谱为青霉素-克林霉素-四环素。猪源分离株耐药最严重，多数环丙沙星耐药株来自猪。基因组分析鉴定出14种AMR基因，四环素耐药基因tetA(P)检出率94.51%，tetB(P)检出率65.93%（鸡源最高86.67%）。猪源分离株中erm(Q)、lnu(P)、ant(6)-Ib、aac(6')-aph(2'')等基因富集，菌株NMG-1携带optrA基因（介导恶唑烷酮类和苯丙醇类耐药）。
3.3 产气荚膜梭菌防御系统分析：通过DefenseFinder分析，所有91株均携带限制性修饰（RM）系统（100%），其他防御系统分布呈菌株特异性。CRISPR-Cas系统（47.25%）和PD-Lambda-1系统（46.15%）分布最广，CoCoNut、BREX等在20-30%分离株中存在，Dnd、Shango等低于20%。猪源分离株防御系统多样性最丰富，CoCoNut在猪和牛中更常见，pAgo在禽类中更常见。某些分离株如HB1-6携带多种防御系统（RM、Cas、PD-Lambda-1、HEC-05、CoCoNut、Shango等）。
3.4 序列型（STs）和最小生成树分析：MLST鉴定出59个STs，其中42个为新发现（提交37个新等位基因和42个新STs）。ST39为猪源主要克隆（14/91, 15.38%），覆盖黑龙江、辽宁、广西三省六地区，占猪源分离株23.73%。ST21为鸡源主要克隆（4/17, 23.53%），来自黑龙江三地区。其他STs（如ST1114、ST1152等）多来自猪，46个STs各仅含一株。
3.5 系统发育和遗传多样性分析：基于MLST的克隆复合体（CCs）分析显示，主要CCs（CC1-CC4）占34.07%（31/91）。CC2最大（19.78%），含ST39、ST1130、ST1153，跨黑龙江、辽宁、广西猪场；CC4含ST21和ST925，来自黑龙江鸡场。系统发育树与最小生成树总体一致，但CC1菌株在进化树上分散，提示MLST与全基因组进化有时不完全一致。
3.6 优势ST39菌株的基因谱：对14株ST39分析，所有菌株携带8种耐药基因，64.29%（9/14）为MDR。tetA(P)（100%）、ant(6)-Ib（85.71%）、erm(Q)（50%）等基因普遍，少数携带blaTEM-116。所有ST39菌株携带10种以上毒力基因，包括定殖相关因子（colA、nagH、nanH等）和成孔毒素pfoA。防御系统谱显示RM、PD-Lambda-1、Cas、Dnd普遍（>50%），BREX、AbiQ等中等频率（20-50%）。表明ST39为猪群中广泛传播的细菌克隆群，具有多重耐药、强肠道定殖能力和多样防御系统。
讨论部分总结：本研究分离率26.07%，与国内外报道相当，肠内容物和粪便分离率显著高于肛拭子和器官样品。毒素基因分析中所有毒素类型（除F型和D型）均检出，但发现非典型宿主中毒素类型转移现象（如G型在牛和鹅中检出），可能通过质粒接合转移。耐药性方面，青霉素-克林霉素-四环素耐药模式突出，tetA(P)和tetB(P)高频，但表型与基因型不完全一致，可能因CLSI缺乏专属折点及青霉素结合蛋白改变等机制。猪源分离株耐药最严重，与集约化养猪历史用药相关。菌株NMG-1携带optrA基因，该基因可转移至人，构成“One Health”风险。防御系统分析首次系统描绘食用动物源产气荚膜梭菌防御系统全景，RM系统普遍存在，其他防御系统呈菌株特异性和宿主偏好性，猪源防御系统最丰富，可能与高密度养殖环境下的噬菌体压力有关。MLST显示高遗传多样性（超70%新ST），ST39为猪源优势克隆，具有跨地域传播能力，其携带的定殖因子、多重耐药基因和丰富防御系统使其适应性极强，对食品安全构成风险。研究结论：本研究通过全基因组测序系统揭示了来自中国食用动物的产气荚膜梭菌的遗传特征。分离株携带丰富的毒素和抗菌药物耐药基因，具有高遗传多样性，其中多重耐药ST39克隆尤其突出。该克隆整合了强定殖能力、MDR和多样的噬菌体防御系统，表现出高适应性，对食品安全和公共卫生构成重大风险。研究结果强调了加强农场层面抗菌药物耐药性监测和实施减抗策略的必要性，以遏制此类高风险克隆的传播。
