基于3D支架的工程化脑类器官揭示二苯酮-3（Benzophenone-3, BP-3）与Wnt/β-catenin失调相关的突触相关毒性

《Environmental Technology & Innovation》：Engineered Brain Organoids on a 3D Scaffold Reveal Synaptic-Related Toxicity of Benzophenone-3 Associated with Wnt/β-catenin Dysregulation

二苯酮-3（Benzophenone-3, BP-3），一种常用于防晒霜中的常见紫外线（Ultraviolet, UV）吸收剂，因其早期暴露可能干扰正常的神经发育而日益受到关注。在本研究中，研究人员制备了一种3D反蛋白石聚乙二醇二丙烯酸酯（Polyethylene Glycol Diacrylate, PEGDA）支架，并建立了一个支架支持的脑类器官模型，用于在体外评估BP-3诱导的神经毒性。扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）表征显示，该支架具有高度有序的多孔形态和均匀的孔径，并表现出良好的类器官培养生物相容性。BP-3暴露诱导了脑类器官中浓度和时间依赖性的毒性反应，在暴露72小时后，50和100 μM浓度下观察到的效应更为显著。在这些明确的暴露条件下，BP-3与活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）增加、钙相关功能改变、膜完整性受损、细胞毒性增加、突触结构标志物表达减少以及Wnt/β-catenin相关蛋白表达改变有关。这些发现表明，在此模型中，BP-3暴露可能破坏早期神经发育相关过程，并与突触相关改变及Wnt/β-catenin失调有关。综上所述，本研究支持了支架支持的脑类器官作为受控实验条件下评估BP-3诱导的神经毒性反应的体外平台的应用潜力。

论文解读

研究背景与意义

二苯酮-3（Benzophenone-3, BP-3）作为一种广泛使用的紫外线（UV）过滤剂，普遍存在于防晒霜和个人护理产品中。由于其具有广谱紫外线吸收和光稳定性，BP-3已成为环境中常见的化学污染物。现有证据表明，BP-3能够穿透胎盘屏障，在孕妇血清、脐带血、母乳及羊水中均被检出，这使得胎儿在神经发育的关键窗口期面临潜在的化学暴露风险。尽管既往动物模型和二维（2D）细胞研究提示BP-3可能导致认知障碍和氧化应激，但由于物种差异或缺乏三维（3D）神经发育微环境，其在人类神经发育早期对突触发生的具体影响机制尚不明确。为此，研究人员开展了一项研究，旨在通过构建工程化的3D脑类器官模型，深入探究BP-3暴露对人类神经发育的潜在毒性及其分子机制。该研究发表于《Environmental Technology & Innovation》。

关键技术方法

为实现上述研究目标，研究人员采用了几项关键技术方法。首先，利用微流控技术制备了具有反蛋白石结构的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶支架，为类器官生长提供可控的微环境。其次，研究构建了基于HT22细胞系和原代神经细胞的脑类器官模型，并通过免疫荧光染色验证了类器官中神经上皮及皮层标记物的表达。在毒性评估方面，研究人员设定了不同浓度梯度和时间梯度的BP-3暴露实验，综合运用了活/死细胞双染、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法、活性氧（ROS）检测、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、钙离子（Ca²⁺）成像以及蛋白质免疫印迹（Western Blot）和免疫荧光技术，系统性地分析了BP-3对细胞活力、氧化应激、线粒体功能及Wnt/β-catenin信号通路的影响。

研究结果

PEGDA水凝胶支架的制备、表征和生物相容性

研究人员通过微流控装置成功制备了PEGDA支架。扫描电子显微镜（SEM）观察显示，该支架具有高度有序的3D多孔结构，孔径约为250 μm，有利于细胞生长。生物相容性测试表明，HT22细胞在支架上表现出典型的3D生长特性，且随着培养时间延长，细胞活力显著提高，证实了该支架是后续研究的可靠平台。

3D支架上脑类器官的表征

研究构建的脑类器官在支架上成功形成了特定的空间组织结构。免疫荧光结果显示，神经前体细胞标记物SOX2、前脑特异性标记物TBR1以及皮层深层神经元标记物CTIP2均在相应区域呈阳性表达。这表明该3D培养系统成功模拟了早期端脑发育中的放射状层状组织过程及皮层板的分层结构特征。

细胞活力测定

通过梯度浓度和时间点的活/死染色筛选，研究人员确定了50 μM和100 μM为显著的毒性作用浓度，72小时为最佳暴露时间点。Calcein-AM/PI染色和TUNEL检测均证实，在这两个浓度下，脑类器官的存活率呈剂量依赖性下降，细胞凋亡比例显著增加，确立了后续毒理学评价的暴露参数。

钙离子成像分析

细胞内Ca²⁺水平与神经元功能活动密切相关。研究发现，经50 μM和100 μM BP-3处理72小时后，两种脑类器官模型中的细胞内Ca²⁺荧光强度均显著降低。此外，急性BP-3刺激下的实时钙荧光记录也显示出快速的荧光下降。这表明BP-3暴露改变了脑类器官中钙相关的功能反应活性。

ROS分析

采用DCFH-DA荧光探针检测发现，BP-3处理组的细胞内ROS水平显著高于对照组，且在100 μM浓度下尤为明显。同时，JC-1染色显示BP-3暴露降低了红/绿荧光比值，提示线粒体膜电位下降。这证明BP-3暴露引发了氧化应激反应，并可能涉及线粒体功能障碍。

LDH活性测定

为了进一步评估细胞膜的完整性，研究人员检测了培养上清液中的LDH释放量。结果显示，100 μM BP-3处理组的上清液中LDH活性显著增加。结合活/死染色结果，这进一步支撑了BP-3对脑类器官具有细胞毒性的结论。

Wnt/β-catenin信号蛋白表达

研究重点探讨了突触损伤的分子机制。免疫荧光和Western Blot分析表明，BP-3暴露显著下调了Wnt/β-catenin通路关键蛋白（Wnt5a、β-catenin、GSK-3β和TCF7L2）的表达水平。与此同时，突触结构标记物PSD95和Syn的表达也明显减少。这说明BP-3诱导的突触相关改变可能与Wnt/β-catenin信号通路的失调密切相关。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出，传统的Matrigel?类器官培养存在成分不明确和批次差异大的局限，而本研究采用的PEGDA支架提供了一个更均一、可控的培养环境。研究结果揭示了BP-3神经毒性的多维特征：它不仅能引起氧化应激和钙稳态失衡等早期生化应激反应，还能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，导致突触结构蛋白表达减少和功能受损。尽管本研究存在一定的局限性（如未完全模拟母体-胎儿暴露环境，未进行通路挽救实验），但它有力地证明了支架支持的脑类器官可作为评估环境化学品发育神经毒性的有效体外模型。

结论部分翻译：

总之，本研究建立了一个支架支持的脑类器官模型，用于体外评估BP-3诱导的神经毒性。在明确的暴露条件下，BP-3在脑类器官中产生了浓度和时间依赖性的毒性效应，在暴露72小时后的50和100 μM浓度下观察到的变化更为显著。本研究发现的一个主要机制关联是，BP-3在脑类器官中诱导的突触相关改变（表现为PSD95/Syn表达减少和钙相关功能改变）伴随着Wnt/β-catenin相关信号通路的失调。这些发现支持了支架支持的脑类器官作为受控实验条件下评估BP-3诱导的神经毒性反应的体外平台的实用性。同时，本研究旨在受控实验条件下进行毒理学评估，并非旨在直接复制现实世界的人类暴露场景。总体而言，本工作为在发育神经毒性评估中使用脑类器官模型提供了进一步的证据支持。