《International Journal of Infectious Diseases》：High Burden of Intestinal Protozoan Infections Revealed by Molecular Diagnostics among Schoolchildren in the Marshall Islands: Species Diversity, Genotyping, and Risk Factors
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目的：肠道原虫（intestinal protozoan）感染在资源有限的太平洋岛国仍是重要的公共卫生挑战，但马绍尔群岛共和国（Republic of the Marshall Islands, RMI）尚缺乏分子流行病学数据。方法：研究人员对马朱罗环礁（Ma
目的：肠道原虫（intestinal protozoan）感染在资源有限的太平洋岛国仍是重要的公共卫生挑战，但马绍尔群岛共和国（Republic of the Marshall Islands, RMI）尚缺乏分子流行病学数据。方法：研究人员对马朱罗环礁（Majuro Atoll）215名小学生进行横断面分子流行病学调查，采集粪便标本，采用靶向Cryptosporidium spp.、Entamoeba spp.及Giardia lamblia的PCR检测方法，并通过PCR–RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）、巢式多重PCR（nested multiplex PCR）及集合型特异性PCR（assemblage?specific PCR）进行虫种鉴定与基因分型，采用logistic回归分析危险因素。结果：分子检测显示溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）检出率97.2%，蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）87.0%，隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）2.8%；迪斯帕内阿米巴（E. dispar）100%，莫斯科内阿米巴（E. moshkovskii）75.3%；Cryptosporidium鉴定为微小隐孢子虫（C. parvum，66.7%）、牛隐孢子虫（C. bovis）及猫隐孢子虫（C. felis），提示人畜共患传播；蓝氏贾第鞭毛虫以B集合型（Assemblage B，53.5%）为主。PCR灵敏度显著高于常规镜检，G. lamblia多检出13倍，E. histolytica多检出35倍。危险因素分析发现E. histolytica感染与城市居住地显著相关，Cryptosporidium感染与食用拾自地面的食物显著相关（OR＝6.107；95% CI：1.174–31.782；p＝0.032）。结论：马绍尔群岛肠道原虫感染疾病负担此前被严重低估，需开展分子监测、针对性卫生宣教及改善供水卫生设施。
马绍尔群岛学龄儿童肠道原虫感染分子流行病学研究解读——发表于《International Journal of Infectious Diseases》
本研究针对马绍尔群岛共和国（Republic of the Marshall Islands, RMI）马朱罗环礁（Majuro Atoll）既往仅靠显微镜检查低估水源性原虫感染负担的问题，首次采用PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）系列分子检测手段，对215名小学学龄儿童粪便标本进行Cryptosporidium spp.（隐孢子虫属）、Entamoeba spp.（内阿米巴属，含E. histolytica溶组织内阿米巴、E. dispar迪斯帕内阿米巴、E. moshkovskii莫斯科内阿米巴）及Giardia lamblia（蓝氏贾第鞭毛虫，又称Giardia intestinalis）的定性检测、种/基因型鉴定及危险因素分析，揭示当地肠道原虫感染真实流行水平、物种多样性和集合型分布特征，明确与居住环境及饮食行为相关的感染危险因素，论证常规镜检的严重漏检问题，为太平洋岛国资源受限地区开展分子监测与改进饮用水—环境卫生干预措施提供实证依据。
主要关键技术方法：
研究人员于2015年选取RMI马朱罗环礁6所公立小学共计215名提供合格粪便标本且人口学资料完整的学龄儿童建立横断面样本队列（n＝215，男106例，女109例，平均年龄9.60±2.38岁）。粪便经MIFC（Merthiolate?iodine?formaldehyde concentration，硫柳汞?碘?甲醛浓集法）处理后同时行光学显微镜检查与分子检测。DNA提取采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，以人GAPDH（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，甘油醛?3?磷酸脱氢酶）基因为内对照。Cryptosporidium spp.用18S rRNA基因巢式PCR（nested PCR）检测并经PCR–RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）用SspI和VspI内切酶基因分型；Entamoeba种鉴定用18S rRNA基因PCR及E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii种特异性巢式多重PCR；G. lamblia用SSU?rDNA（small subunit ribosomal DNA，小亚基核糖体DNA）PCR筛查并经triosephosphate isomerase（tpi，磷酸丙糖异构酶）基因assemblage?specific PCR区分为Assemblage A与Assemblage B。采用SPSS 27.0行χ2检验及crude logistic回归分析感染与人口学/行为因素关联，p＜0.05为差异有统计学意义。研究经TMU?JIRB及RMI卫生部批准，监护人签署书面知情同意。
3. Results（结果）
3.1. Demographic characteristics（人口学特征）： 研究对象平均年龄9.60±2.38岁，男女比例接近；58.1%居城区，18.1%城区贫民窟，19.5%农村贫民窟，4.2%农村地区；60.9%至少一名家长就业；52.1%来自6–10人家庭。
3.2. Prevalence of protozoan infections（原虫感染患病率）： PCR检测显示Cryptosporidium spp.阳性6例（2.8%），E. histolytica 209例（97.2%），G. lamblia 187例（87.0%）；非致病性E. dispar全部阳性（100%），E. moshkovskii 162例（75.3%）。E. histolytica近全群分布，G. lamblia最高检出率见于Laura（92.9%）和Rairok（90.6%）。
3.3. Cryptosporidium species composition（隐孢子虫种类构成）： 6例Cryptosporidium阳性标本中C. parvum 4例（66.7%），C. bovis与C. felis各1例（各占0.5%），提示存在人畜共患（zoonotic transmission）途径。
3.4. Giardia lamblia genotyping（蓝氏贾第鞭毛虫基因分型）： 187例G. lamblia阳性中185例可获SSU?rDNA扩增产物，其中99例（53.5%）成功扩增tpi基因且均为Assemblage B，未检出Assemblage A，其余46.5%为非分型（non?typeable）。
3.5. Comparison of PCR and microscopy（PCR与显微镜检查比较）： G. lamblia镜检阳性仅15例（7.0%），PCR阳性187例（86.9%），多检出13倍；E. histolytica镜检阳性6例（2.8%），PCR阳性209例（97.2%），多检出35倍。所有镜检阳性均被PCR确认，大量感染仅靠分子手段发现。
3.6. Risk factors for infection（感染的危险因素）： Crude logistic回归显示E. histolytica感染与城市居住显著相关（OR＝6.894；95% CI：1.224–38.813；p＝0.029）；Cryptosporidium spp.感染与食用从地面捡拾的食物显著相关（OR＝6.107；95% CI：1.174–31.782；p＝0.032）。性别、年龄、BMI、家庭规模、生食肉/菜、饮未煮沸水、餐前洗手、穿鞋、徒手触土等因素无统计学显著关联。
讨论与结论总结：
此为RMI首例采用分子流行病学方法调查学龄儿童水源性原虫感染的研究，揭示当地E. histolytica（97.2%）、G. lamblia（87.0%）及Entamoeba共生感染真实负担远高于既往镜检估算，印证常规显微镜严重低估流行强度。E. dispar全员阳性反映粪便—口腔污染广泛与环境饱和。C. parvum为主且伴C. bovis/C. felis提示家畜（牛、猫）作为储存宿主参与传播，"拾取地面食物"为Cryptosporidium重要暴露途径，与卵囊（oocyst）在潮湿土壤持久存活及氯消毒不敏感特性相符。G. lamblia以人源Assemblage B为主。E. histolytica城市居住相关可能因高密度人口与卫生基础设施不足加剧粪口传播，但因整体极高感染率使地点差异幅度有限。局限含2015年横断面时点数据、Cryptosporidium阳性数少致统计功效低、未做环境水样系统采样、G. lamblia单一位点(tpi)致部分标本未能分型、未行qPCR（quantitative PCR，实时荧光定量PCR）定量载量分析。
结论（ translated from Conclusions）：
上述发现揭示马绍尔群岛以往被低估的肠道原虫感染疾病负担，凸显在该地区开展分子监测、针对性个人卫生与食品安全宣教（尤避免摄食落地污染食物），以及改善供水卫生基础设施与定期对环境土壤及地表水中Cryptosporidium oocysts进行监测的迫切需求。
