全外显子组测序在土耳其原发性纤毛运动障碍家系中鉴定出ARMC4新致病性变异

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Novel pathogenic variant in ARMC4 identified by whole exome sequencing in a Turkish family with primary ciliary dyskinesia

摘要
引言：原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia, PCD）是一种罕见遗传病，影响约1:15,000至1:30,000个体。其特征包括上、下呼吸道疾病、中耳炎、先天性心脏缺陷、内脏反位（situs inversus）、男性不育和脑积水。全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）已成为鉴定与PCD相关新致病性变异的重要工具。
方法：研究人员对两名临床疑似PCD的土耳其同胞（父母健康且为近亲）进行了基于三人组（trio-based）的WES。候选变异经Sanger测序验证，并通过鼻刷活检获取的呼吸道纤毛进行免疫荧光（immunofluorescence, IF）分析进行功能评估。
结果：在两例患病同胞中鉴定出ARMC4的一个新纯合移码致病性变异[c.324dupA; p.Arg109Thrfs*19]。IF分析显示纤毛轴丝中ARMC4蛋白缺失，且DNAH5远端丢失，证实了该变异的功能效应。
讨论：这些发现扩展了ARMC4相关PCD的突变谱，并强调了结合遗传和功能分析对于PCD准确诊断和变异解读的重要性。

论文解读文章

**研究背景**
原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia, PCD）是一种罕见的常染色体隐性或X连锁遗传病，发病率约为1:15,000至1:30,000。该病由纤毛结构或功能缺陷引起，导致黏液纤毛清除功能障碍，临床表现为慢性或反复性上、下呼吸道感染、鼻窦炎、中耳炎、支气管扩张，约50%的患者伴有内脏反位（situs inversus）等偏侧性缺陷，其他特征包括听力丧失、脑积水、男性不育及生育力低下。目前已有超过50个基因被证实与PCD相关，但仍有相当比例病例的遗传病因未明。许多致病性变异发生于编码外动力蛋白臂（outer dynein arms, ODAs）及其相关对接复合体的基因中。ARMC4已被鉴定为ODA对接复合体的关键组分，其功能缺失导致动力蛋白臂组装缺陷和纤毛运动障碍。鉴于土耳其人群中近亲婚配比例较高，增加了纯合致病性变异的可能性，因此开展基于全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）的综合遗传学研究对于阐明PCD的分子病因具有重要意义。

**研究内容与意义**
本研究利用基于三人组（trio-based）的WES技术，对一个近亲婚配的土耳其家系（健康父母、两名患病同胞（FP1和FP2）及一名未患病同胞）进行了遗传病因鉴定。研究人员鉴定出ARMC4基因的一个新移码致病性变异[c.324dupA; p.Arg109Thrfs*19]，并通过Sanger测序验证和共分离分析确认其隐性遗传模式。免疫荧光（immunofluorescence, IF）分析进一步证实该变异导致纤毛轴丝中ARMC4蛋白完全缺失，并引起DNAH5远端定位异常，符合外动力蛋白臂（ODA）对接缺陷的特征。研究结果扩展了ARMC4相关PCD的突变谱，强调了将遗传分析与功能验证相结合对于提高PCD诊断准确性和变异解读可靠性的关键作用。该论文发表在《Frontiers in Molecular Biosciences》。

**关键技术方法**
本研究涉及的主要关键技术方法包括：（1）基于三人组（trio-based）的全外显子组测序（WES），对来自土耳其家系的两名患病同胞及其健康近亲父母进行测序，数据经生物信息学流程分析；（2）Sanger测序用于候选变异的验证和家系共分离分析；（3）免疫荧光（IF）分析，通过鼻刷活检获取呼吸道纤毛，使用抗ARMC4和抗DNAH5抗体进行蛋白定位检测，以功能验证变异效应。研究样本来源于一个土耳其近亲家系，包含两名患病同胞（FP1和FP2）、健康父母及一名未患病同胞。

**研究结果**

**临床特征（Clinical features）**
两名患病同胞（FP1，8岁；FP2，17岁）表现出高度符合PCD的临床特征，包括反复上、下呼吸道感染、慢性鼻窦炎、反复中耳炎、支气管扩张及全内脏反位（situs inversus totalis）。鼻一氧化氮（nasal nitric oxide, nNO）水平显著降低（FP1: 18 ppb；FP2: 17 ppb），低于200 ppb的诊断阈值。PICADAR评分均为10分（>5分强烈提示PCD）。肺功能检测显示FP1接近正常（FEV1占预计值91%，FVC占预计值94%），FP2轻度降低（FEV1占预计值83%，FVC占预计值78%）。两名患者均未观察到新生儿呼吸窘迫综合征。

**遗传学分析（Genetic analysis）**
通过WES数据分析及逐步过滤，最终鉴定出两个候选变异，分别位于ENKD1和ARMC4。其中ARMC4变异（NM_001290020:c.324dupA; p.Arg109Thrfs*19）为单核苷酸重复导致的移码突变，引入第127位氨基酸提前终止密码子，产生截短蛋白。该变异在gnomAD和ClinVar数据库中未见报道。共分离分析显示两例患病同胞为纯合，父母为杂合携带者，未患病同胞不携带该变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会（ACMG/AMP）指南，该变异被分类为致病性（pathogenic），依据包括：PVS1（极强）——移码导致功能缺失，ARMC4功能缺失是PCD的已知疾病机制；PM2（中等）——在人群数据库中缺失；PP1（支持）——家系共分离；PP4（支持）——高特异性PCD表型；PS3（支持）——IF分析证实功能效应。

**免疫荧光分析（IF analysis）**
对患病同胞呼吸道纤毛进行IF分析显示，ARMC4蛋白在纤毛轴丝中完全缺失，而对照个体中ARMC4沿整个轴丝长度分布。同时，DNAH5仅在纤毛近端区域定位，远端缺失，与外动力蛋白臂（ODA）对接缺陷一致。这一结果证实了ARMC4移码变异导致的功能丧失，并解释了DNAH5组装异常。

**总结与讨论**
讨论部分指出，既往土耳其PCD队列的二代测序研究显示显著的遗传异质性，DNAH5为常见致病基因，但各研究间存在差异。近亲婚配增加了纯合致病变异的可能性，而WES等综合基因组学方法对于解决未确诊病例至关重要。IF分析在缺乏透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和高速视频显微镜（high-speed video microscopy, HSVM）的条件下可提供快速的功能学证据。本研究通过将WES与IF分析相结合，在蛋白质水平提供了功能验证，包括ARMC4缺失和DNAH5定位异常，进一步支持了遗传发现的可靠性。研究结论为：研究人员通过WES和IF分析，在土耳其家系中鉴定出ARMC4的一个新移码变异（NM_001290020:p.Arg109Thrfs*19）。TEM未能进行是本研究的局限性。这些发现扩展了ARMC4的突变谱，并强调了整合遗传和功能方法在PCD诊断中的重要性，有助于改善变异解读和未来的遗传诊断及患者管理。